酪蛋白酶促水解过程集总动力学研究

摘要

蛋白酶促水解反应是在酶的催化作用下使蛋白水解生成胨、肽等低分子量产物的生化过程.该文利用集总方法对酪蛋白—胰蛋白酶(Casein-trypsin)水解体系进行了动力学及过程模拟研究,建立了该体系的四集总动力学模型,并对模型进行了参数估算和实验验证,主要内容包括以下几方面:首先,考察了操作条件对酪蛋白水解速度的影响,确定酶解反应初态pH值为8.0,采用直接加入酶粉法;低浓度下胰蛋白酶以热失活为主,水解反应存在最适温度、pH值以及底物和酶浓度比.其次,确定反应灭酶方式为沸水灭酶,色谱检测波长为214nm,水解过程不需要加入胰蛋白酶保护剂;进一步采用高效体积排阻色谱法定性分析胰蛋白酶水解酪蛋白的反应全过程,发现水解产物主要集中于九个色谱峰中,初始反应速度较快,分子量大的多肽不断水解生成分子量较小的多肽,随反应时间的延长,产物分布趋于稳定.最后,以分子量作为标准将反应体系分为四个集总,其中包括一个不溶性组分和三个可溶性组分.通过色谱分析,建立了可溶性组分质量浓度与吸收峰面积之间的线性关系,进而得出随时间变化的水解物浓度分布.在合理假设的基础上,建立了四集总动力学模型.通过测定各集总组分的本征动力学常数,估算出集总模型的反应速率常数.并通过改变实验条件对模型进行了拟合验证,实验值与模型计算值的平均误差为11.6％,说明该模型可实现对蛋白质复杂酶解反应过程的模拟,但参数拟合方法及过程的假设上仍有待进一步完善与改进.全文研究表明,对于蛋白酶促水解复杂反应体系,集总是一种有效的动力学研究方法,并可望用于其它生化复杂反应体系,但其不足之处亦需进一步研究解决.

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1蛋白酶促水解动力学现况

1.1.1酶的基本动力学

1.1.2蛋白酶促水解动力学研究的现状

1.2集总理论及其应用

1.2.1复杂反应体系

1.2.2集总动力学模型的研究方法

1.2.3集总在复杂体系动力学中的应用

1.3蛋白酶促反应集总动力学的研究

1.3.1模型建立的理论基础

1.3.2模型参数估算

1.3.3模型建立的一般步骤

1.4蛋白和多肽的液相色谱分析进展

1.5本课题主要研究内容

第二章胰蛋白酶水解酪蛋白工艺的确定

2.1实验部分

2.1.1材料与仪器

2.1.2实验方法

2.2反应体系的确定

2.2.1底物蛋白的选择

2.2.2胰蛋白酶的选择

2.3胰蛋白酶失活动力学

2.4其他条件的确定

2.4.1反应初态的确定方法

2.4.2直接加入酶粉法

2.4.3酶解过程简析

2.5小结

第三章胰蛋白酶水解酪蛋白全过程色谱分析

3.1实验部分

3.1.1材料与仪器

3.1.2实验方法

3.2分子量标准曲线

3.3灭酶方式及色谱检测波长的确定

3.3.1灭酶方式的确定

3.3.2 Ca2+保护剂加入对胰蛋白酶活性影响

3.3.3色谱检测波长的确定

3.4胰蛋白酶水解酪蛋白过程色谱分析

3.5小结

第四章集总组分制备及其浓度定量分析

4.1实验部分

4.1.1材料与仪器

4.1.2实验方法

4.2集总组分的划分

4.3各集总组分质量浓度与吸收峰面积的关系

4.4固性物浓度变化分析

4.5小结

第五章酪蛋白胰蛋白酶水解集总动力学研究

5.1实验部分

5.1.1材料与仪器

5.1.2实验方法

5.2酪蛋白-胰蛋白酶反应体系集总模型描述

5.2.1蛋白酶促水解反应机理

5.2.2集总动力学模型的基本假设

5.2.3集总反应网络构建

5.2.4集总反应网络数学描述

5.3四集总模型参数估算

5.3.1不溶解组分动力学常数的测定

5.3.2可溶性组分本征动力学常数的测定

5.4反应网络动力学参数的估算

5.4.1 Marquardt法估算动力学参数

5.4.2反应网络动力学参数估算

5.4.3集总模型拟合结果

5.5模型的实验验证

5.5.1实验验证条件下动力学参数的计算

5.5.2实验验证结果

5.5.3模型的误差分析

5.6小结

第六章结论

参考文献

致 谢

附录1

附录2计算程序

2.1 MATLAB程序计算反应速率常数

2.2 C语言程序计算产物分布