树枝状聚赖氨酸及其衍生物载体合成及性能研究

摘要

本文首先研究了双芴甲氧羰基赖氨酸(Di-Fmoc-Lysine)的制备方法，考察了温度，pH值和提取方式等因素对收率以及纯度的影响，并通过HPLC以及ESI-MS对其进行结构分析。研究结果表明，赖氨酸的两个氨基在不同的pH值下，可以先后与Fmoc-Osu反应，生成双Fmoc基团保护的赖氨酸。 以Di-Fmoc-Lysine和Fmoc-Gly-Wang树脂为底物，应用DIC/HOBt固相多肽合成法合成了树枝状聚赖氨酸，并用芴甲氧羰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe)和乙酸(HAc)对合成的多聚物进行了表面功能化修饰。通过核磁共振、质谱对产品进行了结构的表征。研究结果表明，运用该法获得了分子量单一的目标产物，是一种潜在的理想的非病毒载体。 为了满足合成聚合物对质粒的大规模需求，对pGL3质粒的酶切分析、转化、鉴定、提取产物和电泳分析进行了一系列相关研究，为质粒的大规模扩增打下基础。 最后，利用琼脂糖凝胶电泳、荧光分光光度计以及多角度激光散射手段，对合成的多聚物与质粒DNA的缩合作用进行了检测研究。结果显示，在N/P比值为2：1条件下，Phe-PLD-G3能与质粒DNA形成较小的粒径。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1基因治疗概论

1.1.1基因治疗基本概念

1.1.2基因治疗的手段

1.1.3基因治疗途径

1.1.4基因治疗的步骤

1.1.5发展过程及现状

1.2基因传递系统

1.3基因治疗的载体

1.3.1裸DNA

1.3.2脂质体/DNA复合物

1.3.3多聚物/DNA复合物

1.4多肽固相合成(SPPS)的基本原理

1.4.1多肽固相合成的优点

1.4.2多肽固相合成中的氨基保护

1.5组合化学与多肽合成

1.6质粒DNA的提取和纯化

1.6.1质粒载体

1.6.2质粒的提取纯化

1.7本文的主要工作

第二章树枝状多聚赖氨酸及其衍生物的合成与表征

2.1前言

2.2实验材料与设备

2.2.1合成原料

2.2.2实验所用试剂

2.2.3实验仪器

2.3实验方法

2.3.1 Di-Fmoc-Lysine的合成

2.3.2 PLD-G3的固相法合成

2.3.4 PLD-G3的表面功能化(封端反应)

2.4结果与讨论

2.4.1 Di-Fmoc-Lysine高效液相色谱分析

2.4.2 Di-Fmoc-Lysine质谱分析

2.4.3 Di-Fmoc-Lysine核磁共振分析

2.4.4 Fmoc-PLD-G3反应结果

2.4.5 Phe-PLD-G3反应结果

2.4.6Ac-PLD-G3反应结果

2.4小结

第三章pGL3质粒的提取和鉴定

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1主要试剂和仪器

3.2.2菌种及质粒

3.2.3所用溶液的配制

3.3实验方法

3.3.1感受态细胞的制备

3.3.2质粒转化

3.3.3质粒筛选

3.3.4质粒的制备

3.3.5试剂盒对质粒进行快速提取

3.3.6质粒pGL3 Control Vector的限制性酶消化

3.3.7碱裂解法提取质粒粗品

3.3.8琼脂糖凝胶电泳

3.4实验分析

3.4.1质粒转化结果分析

3.4.2碱裂解法提取质粒

3.4.3质粒的酶切鉴定

3.5小结

第四章载体与DNA的缩合作用

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料与设备

4.2.2实验方法

4.3实验结果分析

4.3.1琼脂糖凝胶电泳结果分析

4.3.2荧光强度分析

4.3.3多角度激光散射分析

4.4小结

第五章结论与建议

5.1全文结论

5.2下一步工作建议

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢