聚甲基丙烯酸甘油酯胺基衍生物、硫脲衍生物的合成及其作为基因载体的性能研究

摘要

研究发现硫脲基团可以与pDNA上的磷酸基团产生较强的作用。在本研究中，第一步，通过原子转移自由基聚合(ATRP)合成分子量分布较窄的线型和五臂的聚甲基丙烯酸甘油酯（L-PGMA/S5-PGMA）;第二步，利用不同的二胺三胺，如丁二胺(B)，乙二胺(E)和二乙烯三胺(D)，对PGMA进行聚合后修饰，得到不同胺基修饰不同胺基取代率的胺基聚甲基丙烯酸甘油酯（胺基PGOHMAs），包括L-B，S5-B，L-E，S5-E和L-D;第三步，继续用异硫氰酸甲酯(M)，异硫氰酸丙酯(P)对胺基PGOHMAs进行聚合后修饰，得到不同异硫氰酸酯修饰不同硫脲转化率的聚甲基丙烯酸甘油酯硫脲衍生物(TPGOHMAs)，包括L-BM，L-BP，S5-BM，L-EM，S5-EM和L-DM（其中M代表异硫氰酸甲酯，P代表异硫氰酸丙酯）。对所合成的胺基PGOHMAs和TPGOHMAs高分子进行核磁共振光谱(1HNMR)，傅里叶红外光谱(FT-IR)，凝胶渗透色谱(GPC)，pH滴定及元素分析等表征，得到了修饰成功的高分子。
　　 根据高分子中N元素含量与pDNA中磷酸基团的P元素含量，将所得到的高分子与pDNA构造为不同N/P摩尔比例的复合体，对其作为基因载体的的性质进行研究。通过凝胶电泳实验得到TPGOHMAs比胺基PGOHMAs有更强的负载pDNA的能力。通过透射电镜观察发现:TPGOHMAs/pDNA复合体和胺基PGOHMAs/pDNA复合体都是规则球形粒子，并且粒径范围在60士33nm，比动态光散射实验(DLS)所测定的粒子水合粒径要小。zeta电势测定结果显示:TPGOHMAs/pDNA复合体比胺基PGOHMAs/pDNA复合体拥有更低的粒子电势。有趣的是，凝胶电泳和溴化乙锭(EB)置换实验都说明:与胺基PGOHMAs相比，TPGOHMAs能在较低的N/P比下与pDNA复合。MTT细胞毒性实验结果表明:TPGOHMAs高分子显示出比胺基PGOHMAs更低的细胞毒性。在Huh-7细胞体外转染实验中，除L-DM/pDNA复合体外，其余TPGOHMAs的体外转染效率低于胺基PGOHMAs。使用激光扫描共焦显微镜观察基因复合体的细胞内分布，L-DM/pDNA复合体均匀分散在细胞质里，同时比L-D/pDNA复合体拥有更高的内涵体逃逸率。
　　 通过本文研究发现:选用适当的胺基修饰的PGMA衍生物，TPGOHMAs可以通过静电与非静电（氢键）的协同作用与pDNA发生相互作用。与胺基PGOHMAs相比，细胞毒性降低，转染效率提高，有望成为一种新型的基因载体。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 非病毒载体

1．1．1 聚赖氨酸(PLL)

1．1．2 聚乙烯亚胺(PEI)

1．1．3 聚乙烯亚胺(PEI)衍生物

1．1．4 聚甲基丙烯酸酯

1．1．5 基于糖类的聚合物

1．1．6 聚酰胺(PAA)

1．1．7 生物可降解高分子

1．2 氢键作用的非病毒载体

1．3 本课题的提出

第二章 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物的合成及其表征

2．1 实验仪器及试剂

2．1．1 实验仪器与主要设备

2．1．2 材料与试剂

2．1．3 试剂的的纯化

2．2 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物的合成

2．2．1 线性和五臂聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)和胺基聚甲基丙烯酸甘油酯(胺基PGOHMA)的合成

2．2．2 聚甲基丙烯酸甘油酯硫脲衍生物(TPGOHMA)的合成

2．3 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物的表征

2．3．1 结构表征

2．3．2 pKa的测定

2．4 结果与讨论

2．5 结论

第三章 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物／pDNA复合体的制备及其作为基因载体的性能研究

3．1 实验仪器与试剂

3．1．1 实验仪器与主要设备

3．1．2 材料与试剂

3．2 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物／pDNA复合体的制备

3．2．1 菌体的培养与质粒pEGFP-N1的提取

3．2．2 固／液体培养基(LB)配制

3．2．3 菌体培养(摇菌)

3．2．4 质粒提取

3．2．5 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物与pDNA复合体的制备

3．3 聚甲基丙烯酸甘油酯胺基和硫脲衍生物／pDNA复合体作为基因载体的性能研究

3．3．1 动态光散射(DLS)

3．3．2 凝胶电泳实验

3．3．3 EB置换实验

3．3．4 透射电镜(TEM)

3．3．5 细胞毒性试验

3．3．6 体外转染Huh-7细胞实验

3．3．7 激光扫描共焦显微镜

3．4 结果与讨论

3．4．1 动态光散射(DLS)

3．4．2 凝胶电泳实验

3．4．3 EB置换实验

3．4．4 透射电镜(TEM)

3．4．5 细胞毒性试验

3．4．6 体外转染Huh-7细胞实验

3．4．7 激光扫描共焦显微镜

3．5 结论

第四章 结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢