用基因组重排和进化工程进行菊糖芽孢乳杆菌菌种改进

摘要

本文以菊糖芽孢乳杆菌SP-BME126为出发菌株，将基因组重排技术和进化工程相结合，进行了具有耐酸性的菊糖芽孢乳杆菌D-乳酸高产株的选育。
　　 首先通过UV、DES诱变和pH梯度筛选三种方法，筛选出8株遗传稳定性较高的菌株，构建了基因组重排的亲本菌株库。利用响应面实验设计方法对菊糖芽孢乳杆菌原生质体的制备及再生条件进行了研究，其优化条件为：菌龄12h，酶浓度7.75mg/mL，酶解时间1.59h，酶解温度38℃。在此条件下菊糖芽孢乳杆菌原生质体制备率和再生率的乘积可达到59.6％，在RSM优化工艺条件的基础上，得到8种原生质体，分别研究了PEG浓度、融合温度、融合时间以及Ca2+浓度对原生质体融合的影响。经过三轮有效的基因组重排，得到高产D-乳酸的基因组重排菌F3-3，通过在MRS发酵培养基(pH5.0)中发酵培养，其菌体OD值达到3.84，D-乳酸最大积累浓度为66.5g/L。
　　 用进化工程的方法对基因组重排菌F3-3进行了耐酸性的进化选择。首先确定了菌株在不同pH下的代时和筛选压力，通过在恒定pH和梯度pH下的持续进化选择，发现梯度pH进化筛选耐酸性菌株效果优于恒定pH下的筛选。将进化工程菌EV-1在pH5.0的MRS发酵培养基中进行发酵罐培养，其最大OD值为3.89，D-乳酸的最大产量为85.2g/L。
　　 通过将96孔板和生物传感器分析有机结合，确定了在高通量筛选中菌株培养时间为3天，D-乳酸提取溶剂为无菌水，以0.015％溴甲酚紫作为微孔板培养中的筛选试剂，在此基础上确定了一种用于胞外代谢物的菌株高通量筛选方法。
　　 利用GC/MS和HPLC等分析手段对D-乳酸发酵过程中胞内外的代谢产物进行了分析，推测出14种胞内代谢物；建立了S.inulinus菌的代谢通量模型；通过代谢通量分析和关键酶活分析，对比了进化工程菌EV-1和出发菌株SP-BME126在不同发酵时期的代谢通量分布情况和关键酶活的变化。
　　 通过单因素实验、P-B实验和中心组合实验设计对进化工程菌EV-1的发酵工艺条件进行了优化，其优化条件为：葡萄糖95g/L、蛋白胨22g/L、种龄24h、接种量5％、碳酸钙3g/100mL、装液量112mL/500mL、温度35℃。在pH5.0的MRS优化培养基中发酵培养，菌株最大D-乳酸产量为91.7g/L，葡萄糖转化率达到96.5％，较优化前的进化工程菌株EV-1(85.2g/L)提高了7.63％。

目录

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第一章文献综述

1.1乳酸的结构、性质和应用

1.1.1乳酸的结构和性质

1.1.2 D-乳酸的应用及商业生产

1.2 D-乳酸的生物合成

1.2.1菌种选育

1.2.2培养条件的优化

1.2.3基因工程技术的应用

1.3基因组重排技术

1.3.1基因组重排的定义

1.3.2基因组重排的技术基础

1.3.3基因组重排的研究方法

1.3.4基因组重排的国内外研究进展

1.4进化工程

1.4.1进化工程的原理与方法

1.4.2进化工程的应用进展

1.5统计学方法优化工艺条件

1.5.1 Plackett-Burman实验设计

1.5.2.最陡爬坡法

1.5.3响应面方法

1.5.4响应面方法的应用

1.6选题背景及研究内容

第二章基因组重排亲本菌株库的构建

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2实验仪器

2.1.3实验药品与试剂

2.1.4培养基

2.1.5培养方法

2.2实验方法

2.2.1出发菌株生化特性研究

2.2.2分析方法

2.2.3诱变与梯度筛选

2.3实验结果与讨论

2.3.1出发菌株的形态学研究

2.3.2出发菌株的发酵曲线

2.3.3出发菌株的pH适应性研究

2.3.4诱变剂量的确定

2.3.5紫外诱变结果

2.3.6硫酸二乙酯诱变结果

2.3.7 pH梯度筛选结果

2.3.8突变株稳定性分析

2.4本章小结

第三章基因组重排构建基因多样性菌群

3.1实验材料

3.1.1菌种

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4培养基及溶液

3.2实验方法

3.2.1原生质体的制备

3.2.2原生质体的再生与融合

3.2.3基因组重排参数的计算

3.2.4.基因组重排

3.3实验结果与讨论

3.3.1原生质体制备的影响因素

3.3.2中心组合设计

3.3.3 RSM模型

3.3.4原生质体的制备

3.3.5原生质体融合的影响因素

3.3.6基因组重排构建遗传多样性菌群

3.3.7融合子的产乳酸能力稳定性检验

3.4本章小结

第四章人工选择下的适应进化

4.1实验材料

4.1.1菌种

4.1.2实验仪器

4.1.3实验试剂

4.1.4培养基

4.2实验方法

4.2.1选择压力的的确定

4.2.2菌株代时的确定

4.2.3恒定pH下的进化培养

4.2.4梯度pH下的进化培养

4.2.5进化工程的研究流程

4.3实验结果与讨论

4.3.1菌株代时的确定

4.3.2选择压力的确定

4.3.3进化策略的选择

4.3.4两种pH调控进化的比较

4.3.5菌群进化适应性研究

4.4本章小结

第五章改进表型的高通量筛选

5.1实验材料

5.1.1菌种

5.1.2实验仪器

5.1.3实验试剂

5.1.4培养基

5.2实验方法

5.2.1 96孔板的细胞培养

5.2.2菌株筛选流程

5.2.3 D-乳酸及OD值的测定

5.3实验结果与讨论

5.3.1菌株培养时间的确定

5.3.2提取溶剂的确定

5.3.3检测方法的确定

5.3.4筛选剂的确定

5.3.5进化株的高通量筛选

5.4本章小结

第六章 D-乳酸耐酸高产进化工程菌的表征

6.1实验材料

6.1.1菌种

6.1.2实验仪器

6.1.3实验试剂

6.1.4培养基

6.2实验方法

6.2.1胞外主要代谢产物的检测

6.2.2胞内主要代谢产物的检测

6.2.3酶活分析

6.3结果与讨论

6.3.1代谢物组学研究

6.3.2代谢通量分析

6.3.3出发菌株和进化工程菌株酶活分析

6.4本章小结

第七章响应面法优化进化工程菌发酵培养工艺条件

7.1实验材料

7.1.1菌种

7.1.2实验仪器

7.1.3实验试剂

7.1.4培养基

7.1.5培养方法

7.2实验方法

7.2.1 D-乳酸的测定

7.2.2实验设计和数据分析

7.3实验结果与讨论

7.3.1单因素实验研究

7.3.2 Plackett-Burman实验设计法筛选重要因素

7.3.3最陡爬坡实验

7.3.4响应面法优化发酵工艺条件

7.4本章小结

第八章 结论与展望

8.1结论和创新点

8.1.1主要结论

8.1.2创新点

8.2展望

参考文献

论文发表及参与科研项目

致谢