农杆菌介导法将PSY基因转入玉米自交系的研究

摘要

维生素A缺乏被世界卫生组织列为世界四大营养缺乏病之一。玉米作为世界上分布面积最广泛的粮食作物之一，却不含维生素A，以其为主食远远不能满足人体对维生素A的需要。因此玉米中维生素A的提高，将极大的改善贫困地区人群营养状况。通过转基因方法提高玉米中维生素A的含量是一条经济而切实可行的方法。
　　 本论文以类胡萝卜素合成途径中的重要关键酶八氢番茄红素合成酶(PSY，phytoene synthase)为目的基因，旨在通过农杆菌介导法将PSY基因转入玉米优良自交系，以获得高维生素A原含量的转基因玉米新品质。目的基因PSY来源于草原龙胆，将其插入带有35S启动子和bar基因筛选标记的表达载体pCAMBIA2300中，构建了植物表达载体，并转入农杆菌C58中获得了工程农杆菌。实验中以优良玉米自交系7922，238，265，p138等的幼胚为材料，接种在诱导培养基上进行培养以获得愈伤组织。结果发现，幼胚大小在1～2mm，幼胚接种时盾片向上放置，愈伤诱导率较高。此外，愈伤的诱导受基因型和培养基成分的显著影响。7922，238和265的二型愈伤可长期继代并再生出植株，培养基中添加半胱氨酸和硝酸银能显著降低愈伤的褐化率。用农杆菌C58介导法转化7922，238等的二型愈伤，在转化前对愈伤的抗性进行了研究，发现草丁膦(L-phosphiothricin，PPT)浓度在5mg/t，时，愈伤有80％死亡，所以将筛选浓度定为5mg/L。对影响农杆菌转化效率的因素进行研究，发现侵染时间在15min，共培培养基中添加葡萄糖和MES时，抗性愈伤率最高。通过PPT筛选获得17株抗性植株，经过PCR分子检测初步证明，有3株植株中整合有PSY外源基因。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 研究的目的和意义

1.2 植物类胡萝卜素生物合成及其相关的酶

1.2.1 类胡萝卜素的分子结构及其生理功能

1.2.2 类胡萝卜素的生物合成途径

1.2.3 类胡萝卜素合成关键酶及编码基因

1.3 类胡萝卜素合成相关基因在植物基因工程中的应用

1.3.1 提高作物中类胡萝卜素水平的途径

1.3.2 国内外研究进展和问题

1.4 玉米转基因研究进展

1.4.1 国内外研究现状

1.4.2 玉米转基因方法

1.4.3 玉米转基因体系研究

1.5 转基因作物安全性评价和应用前景

1.5.1 转基因作物安全性评价

1.5.2 转基因作物应用前景

第二章 植物表达载体的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 植物表达载体的构建

2.1.3 工程农杆菌的制备

2.2 结果与分析

2.2.1 实验流程图

2.2.2 PSY与pCAMBIA2300-NPTII的连接

2.2.3 植物表达载体pCAMBIA2300-PSY-Bar的构建

2.2.4 农杆菌菌落PCR验证

2.3 讨论

2.3.1 PCR常见问题

2.3.2 限制性酶切和连接反应

2.3.3 筛选标记基因

第三章 农杆菌介导的玉米遗传转化体系的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料、菌株与质粒

3.1.2 主要试剂配制

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 植物培养基配方

3.1.5 玉米幼胚愈伤组织诱导体系的优化

3.1.6 农杆菌介导的玉米愈伤遗传转化体系的建立

3.1.7 抗性植株的检测

3.2 结果与分析

3.2.1 影响胚性愈伤组织诱导因素的研究

3.2.2 影响玉米愈伤农杆菌转化因素的研究

3.2.3 抗性植株的检测

3.2.4 转化率和抗性苗数统计

3.2.5 实验流程示意图

3.3 讨论

3.3.1 关于外植体的选择

3.3.2 愈伤褐化问题

3.3.3 影响转化率的因素

3.3.4 再生苗的移栽

第四章 结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢