采后梨果实糖代谢及酸性转化酶基因克隆表达的研究

摘要

论文以采后黄冠梨果实为试验材料，采用2％CaCl2和1％普鲁兰多糖涂膜处理，研究不同处理对梨果实贮藏期间糖代谢及相关酶活性的影响，同时克隆糖代谢关键酶酸性转化酶的基因(AIV)并进行表达分析，为进一步阐明采后梨果实糖代谢机理，从分子水平揭示果实风味品质机制以及进行梨果实品质改良奠定基础，具有较高的理论和生产应用价值。
　　 本研究优化了梨果实糖类高效液相色谱分析条件。流动相：乙腈(色谱纯)：超纯水，检测器：RID示差检测器，柱温：35℃，流速：1.0mL/min。
　　 不同处理对梨果实生理生化指标影响的研究表明：普鲁兰多糖处理和钙处理均能明显抑制采后梨果实的呼吸作用，延缓果实可滴定酸和总可溶性固形物含量的下降，进而延缓梨果实的后熟和衰老进程，改善梨果实的采后品质。
　　 不同处理对糖代谢及其相关酶活性影响的研究表明：普鲁兰多糖处理和钙处理均能显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地延缓AJ、NI、SS和SPS活性的下降。综合分析各种感官及理化指标，钙处理可以应用于生产实践中维持梨果实贮藏期间的优良品质。
　　 采后梨果实糖含量的变化是多种酶共同作用的结果。相关性分析结果表明，作为梨果实糖代谢的相关酶，AI、NI、SS、SPS在黄冠梨果实糖代谢的过程中均具有重要的功能，其中，AI和SS是黄冠梨果实糖代谢的关键酶。
　　 梨富含多糖和酚类物质，RNA提取难度较大，本研究在传统CTAB法的基础上进行了改进。结果表明：采用改进CTAB法提取的RNA完整性好、条带清晰、无明显降解，且28S和18S RNA的亮度比约为2:1，A260/A280为1.913。
　　 根据GenBank中登录的酸性转化酶基因序列设计特异性引物，以RNA逆转录后得到的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得长度为429bp的酸性转化酶基因片段。核酸序列同源性检索表明，AIV与砂梨(BAG30919.1)的PsS-AIV1司源性为95％，与葡萄(AAB47171.1)的GIN1同源性为83％。
　　 采后梨果实AIV基因差异性表达的研究表明：AIV基因的表达水平随贮藏期的延长呈先上升后下降的变化趋势，在贮藏期3个月时表达水平最高。而同一贮藏期下，对照组AIV基因的表达水平低于同期钙处理组和普鲁兰多糖处理组，表明普鲁兰多糖和钙处理均可延缓采后梨果实AIV基因表达水平的下降，且AIV基因的差异表达情况与AI活性的变化趋势一致。