基于基因组重排技术改良枯草芽孢杆菌产核黄素性能

摘要

本文通过基因组重排得到了新的产核黄素枯草芽孢杆菌高产菌株,并且优化了培养基和流加发酵工艺,得到的主要结果如下:
　　首先通过在Bacillussubtilis RH33工程菌中引入来源于谷氨酸棒杆菌的两个外源突变基因zwf243和gnd361,得到了核黄素产量提高的工程菌株Bacillussubtilis RH33-SGZ,并以此作为基因组重排实验的亲株一。通过发酵验证,相较于B.subtilis RH33,引入外源突变基因的工程菌B.subtilis RH33-SGZ产量提高了近29.7％。通过筛选得到产量恢复的工程菌株Bacillussubtilis X42,其核黄素产量恢复到7.08g/L,以此作为基因组重排实验的亲株二。
　　然后通过基因组重排技术对两亲株进行融合得到融合子,并通过筛选得到核黄素产量提高的新的工程菌株Bacillussubtilis F311。经发酵验证,B.subtilis F311摇瓶发酵产量可以达到约8g/L,比亲株B.subtilis X42提高了约14.2%,比亲株B.subtilis RH33-SGZ提高了约66.7%。
　　应用Plackett-Burman实验设计法对核黄素发酵培养基各个组分的重要性进行研究,确定了影响核黄素生成的3个重要成分分别为葡萄糖、尿素、CuCl2。其中CuCl2为负影响,底水平为0,实验中不再添加CuCl2。选择葡萄糖、尿素进行响应面分析,从而获得核黄素生产的优化培养基。该优化培养基在摇瓶培养中可获得核黄素8.58±0.32g/L,比对照培养基提高了6.98%。
　　最后在5L发酵罐上进行放大培养,最终确定发酵罐培养基以及流加发酵工艺,流加发酵72h后产量可以达到12.8g/L。

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第一章 文献综述

1.1核黄素的理化性质、功能和用途

1.1.1核黄素的理化性质

1.1.2核黄素的功能与用途

1.1.3核黄素的工业化生产

1.2枯草芽孢杆菌核黄素合成途径及其代谢调节机制

1.2.1枯草芽孢杆菌简介

1.2.2核黄素的合成途径

1.2.3 前体物5-磷酸核酮糖的合成以及代谢调节机制

1.2.4产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌的研究进展

1.3基因组重排育种

1.3.1 基因组重排的技术原理

1.3.2 基因组重排育种的优势

1.3.3基因组重排技术的应用

1.4 微生物发酵过程优化策略

1.4.1 统计学方法优化发酵工艺

1.4.2 间歇补料发酵工艺

1.5选题背景及研究思路

1.5.1选题背景

1.5.2研究内容与技术路线

第二章 实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4 主要溶液

2.1.5 培养基

2.2实验方法

2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化[60]

2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.3 PCR

2.2.4 DNA片段的回收和纯化

2.2.5 酶切体系

2.2.6 连接体系

2.2.7 琼脂糖凝胶电泳

2.2.8 枯草芽孢杆菌的Spizizen转化[61]

2.2.9枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取

2.2.10 原生质体融合[62, 63]

2.2.11 融合子的筛选

2.2.12 菌体生长特性的考察

2.2.13 发酵罐发酵

2.2.14 发酵液中核黄素和残糖的测定

2.2.15 蛋白质含量的测定

2.2.16 G6PD和6PGD酶活的测定

2.2.17 引物的设计和基因测序

第三章 实验结果与讨论

3.1 B.subtilis RH33的代谢工程改造

3.1.2 B.subtilis RH33-SGZ菌株的构建

3.2菌株B.subtilis X42的筛选

3.3 基因组重排

3.3.1亲株生长曲线的测定

3.3.2融合子的筛选

3.3.4稳定性试验

3.4 主要生化指标的检测

3.4.1菌株形态

3.4.2 生长曲线对比

3.4.3 发酵液HPLC分析

3.4.4 G6PD和6PGD酶活的检测

3.4.5 外源突变基因的RT-PCR分析

3.4摇瓶发酵优化

3.4.1 Plackett-Burman实验

3.4.2中心组合设计及响应面方法

3.4.3 模型预测与验证试验

3.5发酵罐发酵

3.5.1 发酵罐分批发酵

3.5.2 流加发酵工艺研究

第四章 结论与展望

4.1 实验主要结论

4.2 展望

附表和附图

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢