活性多肽酶促合成、酶解制备及生物应用的研究

摘要

本论文以活性多肽的酶促合成、酶解制备及生物应用为研究内容，开展了以木瓜蛋白酶（papain）为催化剂酶促合成阿斯巴甜前体（Z-APM）、以酪蛋白为底物酶解制备磷酸肽（CPPs）及降压肽、以阿斯巴甜为新型还原剂调控制备金纳米粒子等工作，并完成蛋白酶合成/水解肽键机理剖析及纳米材料制备形貌表征等工作。主要研究内容及结论如下：
　　1.考察了papain催化合成Z-APM的多种影响因素并确定其最佳合成条件：两相比（水/乙酸乙酯），1:15；三乙胺加入量，1.0 mmol/mL（水相）；反应温度，40 ℃；酶加入量，Crude-papain4 mg/mL（水相），Sigma-papain1.6 mg/mL（水相）；反应时间，Crude-papain72 h，Sigma-papain18 h。获得Z-APM较高收率，Crude-papain26％，Sigma-papain33%。
　　2.分析了papain催化合成 Z-APM的机理，并鉴定白色沉淀物质为z-Asp-Phe-Phe-OMe，基于此，采取间歇补料策略，移出产物的同时补加已消耗的底物，使 Crude-papain及 Sigma-papain催化合成 Z-APM的最终得率分别为44.5%、42%。
　　3. APM介导合成了金纳米粒子，TEM、DLS、XRD等表征显示所制备的APM-AuNPs主要存在两种不同范围的粒径分布且呈球型、片状等形貌；以APM-AuNPs催化还原对-硝基苯酚，考察了不同温度及不同催化剂用量下的反应速率，证明其具有较高的催化性能；将APM-AuNPs用于玻碳电极的修饰，测试结果表明，修饰后电极具有较高的灵敏度，有望应用于微量检测领域。
　　4.基于固定金属亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，简称IMAC)原理实现CPPs的富集纯化。SEM、FTIR、XRD表征证实，CM-GLYMO-IDA-Ti4+具有较大比表面积及较强机械性能，是一种优良的多孔吸附介质；不同反应时间的酪蛋白-胰酶水解物经该介质吸/脱附后, HPLC显示其纯度大大提高；体外持钙研究表明，富集后样品较纯化前持钙量显著增加；FTIR及荧光光谱法研究了Ca2+与CPPs之间的相互作用，表明磷酸簇基团以及具有游离羧基的氨基酸残基参与螯合作用。
　　5.采用复酶策略制备酪源降压肽，复酶水解较单酶水解实现了水解度（DH值）的提高，由13.5%（pepsin）、16.4%（pancreatin）、20%（papain）提升到29.3%（pepsin+pancreatin+papain）；经Sephadex G-25分离，得到6个组分且最高抑制活性为68.46%，经Sephadex G-15分离，制备得到活性分别为80%和94%的组分。

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前言

第一章 文献综述

1.1 酶促肽键合成的研究现状

1.2 阿斯巴甜合成的研究现状

1.3 酪蛋白活性多肽的开发与应用现状

1.4 多肽的分离及分析方法

1.5 多肽介导合成纳米金及其应用研究

1.6 本文主要研究内容

第二章 两相体系阿斯巴甜前体的酶促合成

2.1 引言

2.2 实验材料和方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 阿斯巴甜介导金纳米粒子的合成及其应用研究

3.1引言

3.2 实验材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 金属螯合层析纯化制备酪蛋白磷酸肽的研究

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 高活性血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化

5.1 引言

5.2 实验材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 主要创新点

6.3 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢