代谢工程改造大肠杆菌glyA敲除菌株提高L-丝氨酸产量

摘要

L-丝氨酸是生物体内的重要的中间代谢物，可广泛的应用于食品、化妆品以及医药等领域。本文以实验室已有的敲除编码丝氨酸脱氨酶基因sdaA，sdaB和tdcG的大肠杆菌工程菌株EJ3为出发菌株，围绕L-丝氨酸去路的截断以及竞争途径的弱化进行菌株的改造，以提高菌株利用葡萄糖生产L-丝氨酸的能力。在EJ3菌株中过表达甘氨酸裂解系统，苏氨酸到甘氨酸路径中的kbl-tdh基因为菌株提供充足的一碳单位，在此基础上敲除编码L-丝氨酸羟甲基转移酶的基因glyA，截断L-丝氨酸的去路；用谷氨酸棒状杆菌中的serA△197替换大肠杆菌基因组上的serA解除L-丝氨酸的反馈抑制；敲除gpmA、pykF使更多的3-磷酸甘油酸流向L-丝氨酸的合成通路；敲除葡萄糖运输系统的ptsHIcrr，过表达galP基因以提高L-丝氨酸的得率；最后在大肠杆菌的基因组中插入一个拷贝的编码L-丝氨酸合成路径上的酶的基因，使L-丝氨酸的合成路径更加稳定，提高工程菌株生产L-丝氨酸的能力。
　　本文首先在EJ3的基础上过表达甘氨酸裂解系统，由甘氨酸裂系统提供菌体生长需要的一碳单位，在解决一碳单位供应的问题的基础上成功敲除了glyA，通过过表达kbl-tdh基因解除菌体对甘氨酸的依赖，获得工程菌株E4G2，该菌株截断L-丝氨酸的去路，使得L-丝氨酸的产量达到266.3mg/l，菌体的生长状况与EJ3相差不大。
　　为了彻底解除L-丝氨酸对磷酸甘油酸脱氢酶的抑制，用谷氨酸棒状杆菌的serA△197替换大肠杆菌基因组上的serA，同时将L-丝氨酸合成途径中的基因连接到高拷贝组成型质粒上，获得工程菌株E4G5。与E4G2相比，E4G5由于三磷酸甘油酸脱氢酶活性的下降造成其产量较低。
　　为了使更多的前体物流向L-丝氨酸的合成通路，弱化糖酵解途径中的3-磷酸甘油酸到丙酮酸的代谢通路。gpmA与pykF基因敲除菌G13，与其他菌株相比其葡萄糖的利用能力降低，但更多的3-磷酸甘油酸流向L-丝氨酸的合成路径， L-丝氨酸的产量达到744.3mg/l。
　　针对葡萄糖的利用效率问题，将葡萄糖运输系统的ptsHIcrr基因敲除，同时过表达galP基因，利用半乳糖苷透性酶来运输葡萄糖。获得的工程菌株G18可产1222.1mg/l的L-丝氨酸，L-丝氨酸的得率显著提高。
　　高拷贝质粒存在不稳定的问题，为了弥补该不足，在大肠杆菌工程菌株中插入一个拷贝的编码L-丝氨酸合成路径上的相关基因：pgk-serA△197-serB-serC，获得工程菌株G23。该菌株在L-丝氨酸的合成能力上有所提高，可产1928.4mg/l L-丝氨酸。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 L-丝氨酸的基本性质及用途

1.2 L-丝氨酸的代谢

1.3微生物生产L-丝氨酸的研究现状

1.4提高大肠杆菌K-12菌株L-丝氨酸生物合成的策略

1.5本课题的研究内容与意义

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第三章 实验结果与讨论

3.1 L-丝氨酸降解途径的敲除

3.2 L-丝氨酸上游合成路径的加强

3.3 L-丝氨酸竞争途径的弱化

3.4葡萄糖运输途径的优化

3.5 L-丝氨酸合成路径基因的染色体重组

3.6工程菌株的发酵表征

3.7工程菌株的流加发酵

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢