两种人类传染病相关蛋白的表达、纯化及结构研究

摘要

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）和肠道病毒68型（Enterovirus68，EV68）是严重威胁到公共健康的RNA病毒，目前尚未研制出高效的特异性抗病毒药物和疫苗，因此探索病毒的复制机制以及新的药物靶点一直都是病毒学领域研究的重难点。本研究希望通过对与病毒复制相关的两种蛋白结构和功能的研究，为病毒的致病机理以及设计靶向药物奠定良好的基础。
　　HIV是一种感染人类免疫系统细胞的逆转录病毒，分为HIV-1和HIV-2型，其中HIV-1型是在全球范围内流行的艾滋病的主要病原体。宿主细胞为抑制病毒复制表达了限制性因子 APOBEC3H，其 HapⅡ亚型最稳定且具有强抗病毒活性和抑制转座子能力，能与HIV-1 Vif蛋白结合并被Vif拮抗了抗病毒作用，因而被广泛的关注和研究。本研究利用昆虫表达系统表达出大量可溶性A3H hapII蛋白，并证明其能够与HIV-1 Vif特异性的结合。我们将构建好的A3H hapII-His重组粘粒Bacmid转染至昆虫sf9细胞并通过扩增获得第三代病毒，进而感染sf9细胞表达和得到目的蛋白。经Ni-NAT亲和层析纯化的目的蛋白，通过免疫共沉淀实验检测与HIV-1 Vif之间的特异性结合。本论文研究内容成功建立A3H hapII昆虫表达体系，为进一步研究A3H hapII与HIV-1 Vif之间相互作用机制并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。
　　EV68是一种主要感染呼吸道的RNA病毒。近几年，不同地区及国家都有不同程度的EV68型感染疫情爆发，因此 EV68病毒引起了广泛的关注。EV68病毒基因组编码7种非结构蛋白和4种结构蛋白，其中非结构蛋白3A在复制复合物中具有重要的作用。3A蛋白的可溶区N端（1-61）对3A的生物学功能有重要意义，但目前关于EV68型3A-N结构的研究报道较少。本研究主要通过原核表达系统，表达出大量且高纯度的3A-N蛋白并对其结构进行了初步研究。我们将构建的原核表达质粒转化至大肠杆菌 BL21（DE3），诱导表达出His-SUMO-3A（1-61）。经Ni-NTA初步纯化及利用ULP酶除去His-SUMO标签，再通过Ni-NTA、阴离子交换柱、分子筛等方法进一步纯化目的蛋白，最终每升大肠杆菌平均可获得约5mg的目的蛋白，且纯度达到95％以上。之后我们通过化学交联反应来证明得到的目的蛋白的多聚化状态。本论文的研究结果为进一步获取3A蛋白晶体、深入研究3A蛋白功能及以3A蛋白为靶点设计抗病毒药物和疫苗奠定了良好的基础。

目录

声明

第一部分

1.2 HIV-1的基因结构和复制周期

1.3 APOBEC3家族蛋白质

1.4 Vif抑制APOBEC3抗病毒活性的机制

1.5 APOBEC3H蛋白质

1.6 杆状病毒表达载体系统（ baculovirus expression vector system, BEVS）

1.7 研究的目的及意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果与讨论

3.1 APOBEC3H HapII的克隆

3.2 Western blotting检测A3H-His蛋白的表达

3.3 A3H-His蛋白的大量表达及纯化

3.4 A3H-His与Vif的免疫共沉淀实验

第四章 小结

第二部分

1.1 肠道病毒68型病毒（Enterovirus 68, EV-D68）概述

1.2 EV-D68的基因组结构

1.3 EV-D68的生物学特性

1.4 研究的目的及意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 实验结果

3.1 小RNA病毒家族3Ａ蛋白氨基酸序列分析

3.2 pET28a-His-sumo-3A(1-61)质粒的构建

3.3 融合蛋白的验证表达

3.4 目的蛋白的大量表达与纯化

3.5 验证3A（1-61）蛋白多聚体形式

3.6 3A（1-61）蛋白的结构预测

第四章 小结与讨论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢