产藏红花酸的人工酵母细胞的构建

摘要

为了实现微生物异源合成天然类胡萝卜素藏红花酸，以一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母为底盘细胞，利用合成生物学技术构建人工酵母细胞。通过在染色体整合藏红花酸生物合成关键酶β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ），并以质粒的形式导入玉米黄质裂解双加氧酶（CCD）和醛脱氢酶（ALD）。由于酵母内源含有醛脱氢酶，所以首先对8种来源CrtZ和4种CCD进行组合表达并筛选，由欧文氏菌来源的CrtZ和藏红花来源的CCD形成组合的菌株获使得藏红花的最高产量约为231μg/L。之后继续对3种不同来源的ALD进行筛选，来自集胞藻来源的ALD效果最好，使得藏红花酸的产量提高了1.88倍（从231μg/L提高到434μg/L），最终筛选出了合成藏红花酸最优的基因来源。
　　为了提升藏红花酸的产量，通过竞争路径的敲除及提高基因表达量进一步提高前体玉米黄质的产量。法尼基焦磷酸（FPP）作为合成萜烯类天然产物的重要前体，通过敲除Lpp1和Dpp1基因，削减法尼基焦磷酸向法呢醇的转化，为玉米黄质的合成提供更多的前体，使前体玉米黄质的产量提高了1.27倍。在此基础上，通过增加欧文氏菌来源CrtZ的基因拷贝数及调节其启动子的强弱来增强β-胡萝卜素羟化酶的表达强度，使得玉米黄质的摇瓶产量达到96.2 mg/L，通过多拷贝表达藏红花来源的CCD，藏红花酸的产量提高至1.17mg/L，这是目前公开报道异源合成藏红花酸中产量最高的。

目录

声明

前言

第一章 文献综述

1.1 藏红花酸研究进展

1.2 前体类胡萝卜素研究进展

1.3 合成生物学简介

1.4 本课题的研究内容与意义

第二章 实验材料与方法

2.1 实验菌株与质粒

2.2 实验仪器

2.3 实验试剂及配制

2.4 DNA操作方法

2.5 菌株发酵和产物提取

2.6 产物HPLC检测与标准曲线的绘制

第三章 藏红花酸合成路径中外源基因的筛选

3.1 引言

3.2 合成前体玉米黄质重组菌株的构建与对照

3.3 基因CrtZ和CCD的适配等因素对藏红花酸产量的影响

3.4 ALD基因来源的筛选

第四章 藏红花酸前体合成途径优化

4.1 引言

4.2 前体竞争路径关键基因的敲除对玉米黄质产量的影响

4.3 基因多拷贝表达与启动子的调节对玉米黄质产量的影响

4.4 CCD2拷贝数对藏红花酸产量的影响

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢