D-Asp和乙酰化修饰对乳酸乳球菌肽聚糖影响的研究

摘要

肽聚糖（PG）对维持细胞壁形态及机械强度起着关键作用，同时影响着细胞的生长、分裂等。PG的合成是合成酶与水解酶协调的动态过程。为了挖掘乳酸乳球菌F44中PG的合成调控对菌体的生长及应对酸胁迫能力等之间的关系，本文对乳酸乳球菌PG合成及其骨架修饰相关酶进行了相关研究。 不同培养pH下菌体PG结构呈现差异：随着pH降低，PG交联度下降。D-As p是PG肽桥主要成分，对PG合成有重要影响。通过细胞内Asp含量测定发现，随着培养pH降低D-Asp减少，而L-Asp积累，这种巨大波动影响PG结构。进一步通过对Asp消旋酶（RacD）的表达及酶学表征表明pH几乎不影响RacD，但显著影响酶活性进而影响D-Asp含量。酶学动力学实验进一步表明不同pH下RacD催化活性改变调控D-Asp含量，结合体外合成含单糖五肽-D-Asp的PG前体实验结果证明，pH通过影响RacD酶活性调控D-Asp的含量，进而影响细胞壁PG结构。 此外，PG骨架MurNAc的O-乙酰化和GlcNAc的N-去乙酰化修饰对水解酶具有调控作用。通过遗传学手段提高这两种修饰程度可以降低PG对水解酶的敏感性并对PG结构产生影响。通过HPLC-MS分析PG分子结构发现这两种修饰均可提高PG交联度，进而提高细胞壁的稳定性。细胞壁稳定性的增强有利于增强菌体抵抗逆境的鲁棒性，进而降低菌体自溶、提高酸耐受性。酸鲁棒性促进菌体nisin产量，这为工业菌株改造提供了新思路。 本研究首次证明RacD通过感知细胞内pH变化改变其酶活性，进而调控胞内D-Asp合成影响PG结构。同时，PG骨架修饰通过影响水解酶活性调控PG的结构进而提高菌体抗逆境能力以及nisin合成能力。

目录

声明

第1章文献综述

1.1引言

1.2Nisin应用进展

1.3耐酸机制的研究

1.3.1调控胞内pH稳定机制

1.3.2大分子保护及DNA修复机制

1.3.3细胞膜和细胞壁的保护

1.4细胞壁研究进展

1.4.1细胞壁组成成分及结构研究进展

1.4.2肽聚糖研究进展

1.5本论文主要研究内容及意义

第2章RacD通过感知pH变化调控D-Asp合成影响肽聚糖结构

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1培养基和试剂

2.2.2实验药品及仪器

2.2.3供试菌株和质粒

2.3实验方法

2.3.1RacD和AslA体外表达菌株构建

2.3.2乳酸乳球生长曲线测定

2.3.3PG的提取及测定

2.3.4细胞内氨基酸的定量

2.3.5RacD-His和AslA-His蛋白纯化

2.3.6酶活性的测量和动力学参数的测定

2.3.7体外合成肽聚糖前体（UDP-MurNAc-五肽-D-Asp）

2.3.8胞内pH（pHi）的测定

2.3.9iTRAQ标记的蛋白质组学测定

2.4结果与讨论

2.4.1不同培养pH条件对PG结构影响

2.4.2不同培养pH下D-/L-As含量变化

2.4.3pH对RacD和AslA表达量的影响

2.4.4pH对RacD和AslA酶活的影响

2.4.5PG前体（UDP-MurNAc-五肽-D-Asp）的体外合成

2.4.6RacD酶活动力学

2.4.7动力学角度分析pH对RacD酶活影响参数

2.5本章小结

第3章PGO-乙酰化和N-去乙酰化修饰对肽聚糖结构及酸耐受的影响

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1培养基和试剂

3.2.2实验药品及仪器

3.2.3供试菌株和质粒

3.3实验方法

3.3.1xynD和yvhB过表达菌株构建

3.3.2xynD和yvhB缺失菌株的构建

3.3.3xynD和yvhB共表达菌株构建

3.3.4AcmA体外表达

3.3.5细胞壁肽聚糖提取与结构鉴定

3.3.6菌体的自溶实验

3.3.7溶菌酶和AcmA介导的细菌水解实验

3.3.8溶菌酶和AcmA介导的PG水解实验

3.3.9酸耐受实验

3.3.10乳酸乳球菌分批发酵发酵及nisin效价测定

3.3.11乳酸乳球菌补料-分批发酵发酵及nisin效价测定

3.3.12nisin吸附率的测定

3.4结果与讨论

3.4.1YvhB、XynD分别催化O-Ac-M和N-deAc-G

3.4.2提高O-Ac-M和N-deAc-G水平有助于菌体抵抗裂解

3.4.3O-Ac-M和N-deAc-G有助于提高细胞壁稳定性

3.4.4O-Ac-M和N-deAc-G提高菌体的酸耐受性

3.4.5提高O-Ac-M和N-deAc-G水平促进nisin产量提高

3.4.6同时提高O-Ac-M和N-deAc-G水平进一步提升菌体特性

3.5本章小结

第4章结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文情况说明

致谢