无细胞代谢工程生产手性纯度乙偶姻

摘要

乙偶姻，又名3-羟基2-丁酮，是一种重要的食品添加剂。乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为优先开发的30种平台化合物之一，广泛应用于医药、农业、化工领域。本研究利用无细胞代谢工程技术，通过耦合NAD+再生酶实现辅因子再生，使用2,3-丁二醇脱氢酶体外催化meso-2,3-丁二醇高效合成乙偶姻。经过筛选两种酶、测定动力学参数以及比较两种酶耦合生产乙偶姻的性能，选择最适的NAD+再生酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶。再通过此双酶系统的反应优化，实现乙偶姻的高产。 首先，选择以meso-2,3-丁二醇为底物合成乙偶姻，反应中NAD+的再生通过耦合NAD+再生酶实现。对反应中的meso-2,3-丁二醇脱氢酶和NAD+再生酶进行筛选，选择了来源于Bacillus subtilis的NADH氧化酶（BS-NOX）和来源于Candida tenuis的木糖还原酶（CT-XR）两种NAD+再生酶，来源于Bacillus subtilis,Corynebacterium glutamicum,Pyrococcus furiosus,Parageobacillus thermoglucosidans的四种meso-2,3-丁二醇脱氢酶（BS-BDH、CG-BDH、PF-BDH、PT-BDH）。由BS-BDH分别与两种NAD+再生酶耦合反应，根据乙偶姻产量高低选择了CT-XR进行NAD+的再生。利用CT-XR分别与四种BDH耦合生产乙偶姻，根据乙偶姻的产量和手性纯度，选择了CG-BDH进行手性乙偶姻的生产。 然后，对CG-BDH耦合BS-NOX的双酶反应体系进行优化，主要优化了反应温度、反应pH、反应所用缓冲液、底物比例、酶比例。确定反应的最优反应条件是37℃，pH7.5，PBS缓冲液，最优的meso-2,3-丁二醇∶木糖的比例为1∶1.5，最优的CG-BDH∶CT-XR的比例为1∶1。经过优化，乙偶姻的转化率由17.7%提高到50.1%。 最后，为获得手性乙偶姻的更高产量，增大meso-2,3-丁二醇浓度至584.9mM，增大木糖浓度至847.7mM，结果乙偶姻的产量增加至323.9mM(28.5g/L),木糖醇浓度达到268.6mM(40.29g/L)。meso-2,3-丁二醇转化率为55.4%，乙偶姻产率高达4.75g/L/h，得率是理论得率的99%，手性纯度达到95.2%。本研究表明，利用CT-XR可以有效实现NAD+再生的策略，本文构建的双酶反应体系是一种绿色经济的手性乙偶姻生物合成法。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1无细胞代谢工程概述

1.1.1 无细胞代谢工程的发展与应用

1.1.2 无细胞代谢工程的优势和挑战

1.1.3 无细胞代谢工程中辅因子再生策略

1.2 乙偶姻概述

1.2.1 乙偶姻的理化性质

1.2.2 乙偶姻的应用

1.2.3 乙偶姻的合成方法

1.3 选题背景及主要研究内容

1.3.1 选题背景

1.3.2 主要研究内容

第2章 酶的筛选、表达、纯化和特征参数研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 实验仪器

2.1.3 主要试剂与培养基

2.2 实验方法

2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态的制备

2.2.2 大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态的化学转化

2.2.3 枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的基因组DNA的提取

2.2.4 NAD+再生酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶的筛选

2.2.5 重组质粒的构建

2.2.6 pET28a系列质粒的提取

2.2.7 酶的诱导表达

2.2.8 酶的分离纯化

2.2.9 蛋白浓度的测定

2.2.10 NADH标准曲线的制作

2.2.11 酶最适温度的测定

2.2.12 酶最适pH的测定

2.2.13 比活力的测定

2.2.14 Km的测定

2.2.15 酶的稳定性分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 途径的构建

2.3.2 酶的筛选

2.3.3 PCR扩增目的基因的结果

2.3.4 质粒的构建

2.3.5 酶的分离纯化

2.3.6 酶浓度的测定

2.3.7 酶的最适温度

2.3.8 酶的最适pH

2.3.9 酶的动力学分析

2.3.10 酶的稳定性

2.4 小结

第3章 无细胞代谢工程合成手性乙偶姻

3.1 实验材料

3.1.1 主要仪器和设备

3.1.2 实验药品与试剂

3.2 实验方法

3.2.1 最适NAD+再生酶的选择

3.2.2 最适meso-2,3-丁二醇脱氢酶的选择

3.2.3 体外双酶催化合成手性乙偶姻的优化

3.2.4 底物产物浓度的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 最适NAD+再生酶的选择

3.3.2 最适meso-2,3-丁二醇脱氢酶的选择

3.3.3 体外双酶催化合成手性乙偶姻的优化

3.3.4 最适条件下的手性乙偶姻的高产

3.4 小结

第4章 结论与展望

4.1 结论

(2) CFME生产乙偶姻 生产乙偶姻

4.2 展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢