产虾青素酿酒酵母的单碱基突变进化和基因组重排

摘要

虾青素是一种红色的，脂溶性类胡萝卜素，因其很强的抗氧化性，广泛应用于医疗化妆品领域，具有潜在的市场价值和应用前景。 本研究以利用合成生物学提高酿酒酵母虾青素产量及挖掘MVA路径靶点为目标，对实验室现有两株突变菌SyBE_Sc2110M1,SyBE_Sc2110M3以及对照菌株SyBE_Sc307001全基因组重测序，通过生物信息学分析，结果发现两株突变菌在编码区（CDS）发生非同义突变以及移码的基因可以分为四个部分，分别是转录调控相关，转座子，细胞壁功能以及功能未知蛋白。基于比较基因组分析的结果，在对照菌株SyBE_Sc307001分别单独敲除高频基因CSS1、DAN4、FLO9及突变菌株SyBE_Sc2110M3特有基因YBR012W-B和YLR410W-B。敲除YBR012W-B，CSS1，DAN4后，虾青素产量有提升，其中，敲除CSS1和DAN4后，虾青素产量有显著性提升，分别提高59.6%和36.3%。使用5L发酵罐对产虾青素酿酒酵母菌株SyBE_Sc2110M3进行放大发酵，使虾青素产量提高到217.9mg/L，是目前已报道异源合成虾青素的5L发酵罐水平最高发酵产量。为实现基因组大尺度重排并进一步提高虾青素产量，引入含有合成型五号染色体的酿酒酵母，结合已有的位点特异性重组系统Cre-LoxPSym系统以及细胞拆孢技术，筛选到一株高产虾青素突变株SyBE_Sc307030，虾青素产量是SyBE_Sc2110M3的1.5倍。

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前言

第1章 文献综述

1.1 虾青素

1.1.1 虾青素简介

1.1.2 虾青素的生物合成

1.2 酿酒酵母比较基因组学研究现状

1.2.1 酿酒酵母的基因组结构

1.2.2 基因组差异类型

1.3 基因组重排概述

1.3.1 基因组重排的研究进展

1.3.2 合成型酵母的基因组重排

1.4 本研究的意义和内容

第2章 材料与方法

2.1 菌株

2.1.1 酿酒酵母

2.1.2 大肠杆菌

2.2 仪器

2.3 试剂及配置

2.3.1 实验试剂

2.3.2 常用试剂配制

2.4 培养基配置

2.5 基因操作方法

2.5.1 目的片段的扩增

2.5.2目的片段的回收

2.5.3 DNA的限制酶消化

2.5.4 DNA的连接

2.5.5 大肠杆菌转化

2.5.6 转化子的筛选

2.5.7 大肠质粒提取

2.5.8 酿酒酵母转化

2.5.9 酿酒酵母菌落PCR验证

2.5.10 酿酒酵母基因组提取

2.5.11 酵母交配型的验证

2.5.12 构建二倍体酵母细胞

2.5.13 酵母高效生孢

2.5.14 酵母拆孢

2.6 发酵培养与产物提取

2.6.1 摇瓶发酵培养

2.6.2 虾青素提取

2.6.3 产物检测

第3章 虾青素突变株比较基因组重分析及靶点验证

3.1 引言

3.2 对照菌基因组重测序的基本信息

3.3 对照菌与突变菌基因组比较结果

3.3.1 基因变异的基本信息

3.3.2 编码区变异分析

3.4 验证提高虾青素产量的靶点

3.4.1 发现靶点

3.4.2 靶点敲除对细胞生长和虾青素产量的影响

3.4.4 敲除CSS1对细胞膜组分以及能量代谢的影响

3.5发酵罐（5 L）分批补料发酵提高虾青素产量

3.5.1发酵罐（5 L）分批补料发酵

3.5.2发酵罐（5 L）类胡萝卜素组成趋势

3.6小结

第4章 基因组重排提高产虾青素酿酒酵母产量

4.1 引言

4.2 二倍体酿酒酵母基因组重排

4.2.1 合成型酿酒酵母与产虾青素酿酒酵母细胞融合

4.2.2 基因组重排质粒的构建

4.2.3二倍体酿酒酵母基因组重排

4.3 基因组重排酵母菌株的发酵

4.4 二倍体酿酒酵母细胞拆孢和单倍体孢子发酵

4.4.1 基因组重排二倍体酿酒酵母细胞拆孢

4.4.2 单倍体孢子发酵

4.5 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢