碳代谢流分配及辅因子再生提高大肠杆菌苏氨酸产量

摘要

L-苏氨酸作为一种必需氨基酸，在许多工业领域如食品业、制药业和水产养殖业等都有着广泛应用。目前工业上利用大肠杆菌已经实现了由葡萄糖发酵生产L-苏氨酸。然而，工业中L-苏氨酸的生产受到了多个限制因素的阻碍，例如细胞生长所需与生产所需碳骨架之间的冲突，副产物如乙酸甲酸等的积累，胞内ATP的供给不足以及氧化还原失衡问题。因此本文提出了以下策略来缓解大肠杆菌THRD（一株L-苏氨酸生产菌株）中的上述问题。 首先，通过异源表达来自曼氏产琥珀酸菌的pckA编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和来自乳酸乳球菌的pycA编码的丙酮酸羧化酶以增加草酰乙酸和ATP的供应。构建出的菌株THPR1在摇瓶单批发酵中苏氨酸产量达到1.22g/L，较原始菌株产量（1.08g/L）提高了12.5%。 其次，在菌株THPR1的基础上前期诱导表达来自黑曲霉的citA来增强柠檬酸合酶的活力，同时在发酵后期过表达编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，从而实现碳通量在菌株生长与L-苏氨酸生产之间的分步调控。构建出的菌株THPE2在24h发酵后苏氨酸产量达到1.62g/L，较原始菌株产量提高了49.7%。 最后，为弥补菌株在发酵过程中胞内还原力的不足，向菌株THPE2中引入来自波氏念珠菌的甲酸脱氢酶FDH来增加NADH的供应。为了促进苏氨酸生产途径中的转氨反应，过表达大肠杆菌中的谷氨酸脱氢酶编码基因gdhA，构建了谷氨酸回补系统，同时过表达吡啶核苷酸脱氢酶编码基因pntAB，促进NADH向NADPH的转化。通过优化发酵液中的甲酸钠添加量，最终菌株THPE5的L-苏氨酸产量达到2.18g/L，较原始菌株THRD的产量提高了1.02倍。 本文构建的具有更高产量的大肠杆菌苏氨酸生产菌，将促进苏氨酸生产菌株的进一步改造与工业化应用。同时本文提出的菌株改造策略也为大肠杆菌生产其他代谢物提供了新的思路。

目录

第1章 文献综述

1.1 L-苏氨酸的简介

1.1.1 L-苏氨酸的结构与性质

1.1.2 L-苏氨酸的应用

1.2 L-苏氨酸的生产方法

1.2.1 天然提取法

1.2.2 化学合成法

1.2.3 微生物发酵法

1.3 大肠杆菌发酵生成L-苏氨酸的研究进展

1.3.1 苏氨酸的生物合成途径

1.3.2 L-苏氨酸的代谢改造策略

1.4 辅因子工程

1.5 课题背景、意义及研究内容

第2章 加强中心碳代谢强化苏氨酸的合成

2.1 实验材料

2.1.1 实验所用菌株与质粒

2.1.2 主要仪器与试剂

2.1.3 培养基配制方法

2.1.4 常用试剂的配制

2.1.5 本章所用引物

2.2 实验方法

2.2.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的获取

2.2.2 乳酸乳球菌基因组的提取

2.2.3 引物的验证

2.2.4 目的基因的扩增与回收

2.2.5 目标质粒的提取与酶切回收

2.2.6 感受态大肠杆菌的制备与转化

2.2.7 转化细胞的筛选

2.2.8 大肠杆菌THRD电转化感受态的制备与转化

2.2.9 大肠杆菌的发酵实验

2.2.10 高效液相色谱法测定发酵中的苏氨酸含量

2.3 结果与讨论

2.3.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的异源表达

2.3.2 丙酮酸羧化酶的异源表达

2.3.3 pckA与pycA单独表达对苏氨酸产量的影响

2.3.4 pckA与pycA共表达对苏氨酸产量的影响

2.4 本章小结

第3章 草酰乙酸代谢流向的分阶段调控

3.1 实验材料

3.1.1 菌种

3.1.2 主要仪器与试剂

3.1.3 培养基配制方法

3.1.4 常用试剂的配制

3.1.5 本章所用引物

3.2 实验方法

3.2.1 大肠杆菌基因组的提取

3.2.2 引物的验证

3.2.3 目的基因的扩增与回收

3.2.4 重叠延伸PCR反应

3.2.5 目标质粒的提取与酶切回收

3.2.6 感受态大肠杆菌的制备与转化

3.2.7 转化细胞的筛选

3.2.8 大肠杆菌THRD电转化感受态的制备与转化

3.2.9 菌株THPE1的RNA的提取与反转录

3.2.10 荧光定量 PCR 检测 citA 表达量

3.2.11 柠檬酸合酶酶活的测定

3.2.12 大肠杆菌的发酵实验

3.3.1 柠檬酸合酶的过表达对菌体生长和苏氨酸产量的影响

3.3.2 柠檬酸合酶过表达的分阶段调控

3.3.3 天冬氨酸转氨酶的诱导过表达

3.4 本章小结

第4章 辅因子工程促进胞内NAD(P)H再生

4.1 实验材料

4.1.1 菌种

4.1.2 主要仪器与试剂

4.1.3 培养基配制方法

4.1.4 常用试剂的配制

4.1.5 本章所用引物

4.2 实验方法

4.2.1 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组的提取

4.2.2 引物的验证

4.2.3 目的基因的扩增与回收

4.2.4 目标质粒的提取与酶切回收

4.2.5 感受态大肠杆菌的制备与转化

4.2.6 转化细胞的筛选

4.2.7 大肠杆菌THRD电转化感受态的制备与转化

4.2.8 NAD(H)含量测定

4.2.9 大肠杆菌的发酵实验

4.2.10 高效液相色谱法测定发酵中的苏氨酸含量

4.3 结果与讨论

4.3.1 甲酸脱氢酶的表达对菌体生长和NADH含量的影响

4.3.2 谷氨酸脱氢酶与吡啶核苷酸脱氢酶的共表达

4.3.3 甲酸钠添加量的优化

4.4 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢