乳酸乳球菌F44中耐酸调控因子的筛选与功能研究

摘要

乳酸菌生长过程中会通过糖酵解产生乳酸，乳酸的积累会酸化菌株的生长环境，抑制菌体生长。为了应对酸性环境乳酸菌本身产生了一系列的耐酸机制如质子泵外排氢离子，产生碱性物质中和氢离子等。这些耐酸机制错综复杂且发挥作用需受调控系统控制。因此作为调控系统中最为重要的转录调控因子在乳酸菌耐酸机制方面发挥着重大作用。 为进一步获取有利于菌株耐酸的调控因子，本实验通过分析前期实验数据，分别从不同酸性环境下菌株的转录组与蛋白组数据中选取变化显著地转录调控因子，进行同源过表达后测定酸性环境下的存活率，筛选获得耐酸调控因子YthA和XylR2。调控因子YthA和XylR2能够提高乳酸乳球菌F44的酸性环境下的存活率和nisin产量。 作为调控因子，其发挥作用主要依靠调控下游基因的转录。我们首先利用NCBI确定调控因子XylR2和YthA的类型，根据调控因子类型测定菌株在特殊培养基中的生长状况。转录因子XylR2为木糖调控因子，过表达XylR2有助于菌株利用木糖，促进菌株在木糖作唯一碳源的培养基中生长。转录因子YthA为压力响应转录因子，过表达YthA有助于菌株在酸性环境下（pH6.0）生长，且发酵液pH值下降缓慢。为深入研究耐酸调控因子的下游靶基因以及解释耐酸原理提供基础。 为了进一步了解YthA在L.lactis F44调控影响的基因和耐酸机制，对菌株FythA进行了转录组测序以期寻找受YthA影响的耐酸基因并解释YthA的调控机制及耐酸原理。测序结果发现，转录因子对菌株氨基酸代谢影响最大，多种氨基酸合成途径显著上调加强。另外还有胞外多糖的合成加强，促进菌体分裂的基因上调，nisin相关的基因上调。转录组学数据很好的解释了菌株FythA耐酸性高，后期生长较快的现象。但是YthA具体的调控作用仍有待研究。

目录

声明

第1章文献综述

1.1引言

1.2乳酸菌耐酸机制

1.3转录调控因子与耐受机制研究

1.3.1转录调控因子

1.3.2转录因子与菌株耐受的关系

1.4转录调控因子靶基因的研究方法

1.4.1转录因子表达水平改变引起靶基因转录量改变

1.4.2转录因子特异性结合DNA序列寻找靶基因

1.4.3生物信息学方法

1.4.4荧光定量 PCR 技术

1.5本文研究内容及主要意义

1.5.1研究内容

1.5.2主要意义

第2章 耐酸调控因子的筛选

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1菌株及质粒

2.2.2主要实验设备仪器

2.2.3主要实验药品试剂

2.2.4实验所需培养基及溶液

2.3实验方法

2.3.1乳酸乳球菌F44基因组的提取

2.3.2 PCR引物设计与验证

2.3.3目的基因的扩增和产物纯化回收

2.3.4重组质粒的构建与富集

2.3.5重组质粒电转化乳酸乳球菌F44

2.3.6乳酸乳球菌耐酸存活率的测定

2.3.7乳酸乳球菌发酵过程生长情况的测定

2.3.8乳酸乳球菌nisin产量的测定

2.4实验结果与讨论

2.4.1组学实验下筛选得到差异变化的转录调控因子

2.4.2过表达调控因子对乳酸乳球菌耐酸性的影响

2.4.3转录调控因子对乳酸乳球菌生长速度的影响

2.4.4转录调控因子对乳酸乳球菌发酵液pH值的影响

2.4.5转录调控因子对乳酸乳球菌nisin产量的影响

2.5本章小结

第3章 耐酸调控因子的功能初步分析鉴定

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1仪器和设备

3.2.2主要药品及试剂

3.2.3培养基及所需溶液

3.3实验方法

3.3.1乳酸乳球菌酸性条件下的生长情况测定

3.3.2乳酸乳球菌木糖培养基中的生长情况测定

3.3.3乳酸乳球菌木糖培养基中糖消耗情况的测定

3.4实验结果与讨论

3.4.1过表达XylR2能够促进菌株在木糖培养基中生长

3.4.2过表达XylR2能够加快菌株利用木糖

3.4.3调控因子YthA有助于菌株在酸性环境下生长

3.5本章小结

第4章转录调控因子YthA调控基因的研究

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1菌株及质粒

4.2.2仪器和设备

4.2.3主要药品及试剂

4.3实验方法

4.3.1乳酸乳球菌的活化

4.3.2 RNA测序

4.3.3转录组数据分析

4.3.4荧光定量PCR验证

4.3.5调控因子结合位点的预测

4.4实验结果与讨论

4.4.1转录组分析概述

4.4.2荧光定量PCR验证

4.4.3转录因子YthA促进氨基酸合成与代谢

4.4.4转录因子YthA影响细菌表面与细菌分裂

4.4.5其他方面的影响

4.4.6预测结合位点motif

4.4.7本章小结

第5章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢