运用mRNA差异显示技术分离乳腺癌转移相关基因的研究

摘要

乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤.近年来欧美国投入大量经费及科研力量进行临床及基础研究,但其死亡率仍居高不下,原因主要是由于远处转殉没有得到有效控制.为了从分子基础上对乳腺癌的转移进行研究,该实验采用mRNA差异显示技术分离乳腺癌转移相关基因,以期对揭示乳腺癌转移机理有所帮助.mRNA差异显示(mRNA differential display)技术作为表型克隆技术的一种,为近年来未知基因筛选的研究中所普遍采用并被不断优化,主要方法是用随机引物差别筛选扩增的cDNA.该方法简便、灵敏、适应实验室条件.该实验以乳腺原位癌组织及乳腺转移癌组织为样品,采用3种锚锭引物及2种随机引物进行DDRT-PCR,共发现17条在乳腺原位癌组织及乳腺转移癌组织中差异表达的cDNA片段.将这17个cDNA片段连接入载体pGEM-T Easy,进行克隆,所得的重组质粒经酶切鉴定后,进行外源片段测序.所得序列在Genbank中检索,发现4个未曾登录的新基因,其中def7和def8现已提交给Genbank并被收录,其全长及功能有待进一步研究.转移相关基因的确定可为乳腺癌转移的早期预防和早期发现提供新的基因标志,为抗转移的治疗提供有效的靶基因,具有重要的理论意义和临床应用价值.

目录

摘要

前言

一.乳腺癌相关背景介绍

二.基因克隆的几种方法

三.mRNA差异显示技术

四.实验意义

材料与方法

一.病例选择及标本处理

二.RNA提取

三.DNase处理RNA样品

四.RNA质量检测

五.mRNA差异显示(DDRT-PCR)

六.差异片段的克隆及鉴定

七.测序及检索

结果与分析

一.所取样品的病理背景

二.RNA样品分析

三.Fluoro-DD电泳

四.差异片段二次扩增及克隆

五.差异片段的测序及检索

讨论

附图

参考文献

致谢