应用mRNA差异显示技术筛选小细胞肺癌转移相关基因的初步研究

摘要

目的:应用mRNA荧光差异显示技术,筛选人小细胞肺癌的转移相关基因片段,为今后小细胞肺癌转移机制的研究提供思路.同时,进一步完善mRNA差异显示技术平台.实验方法:1.应用Pix cell Ⅱ LCM激光显微细胞俘获系统分别提取小细胞肺癌原发癌和淋巴结转移癌的单纯癌细胞各约8000个.2.Trizol法分别提取小细胞肺癌原发癌与淋巴结转移癌的RNA.将LCM捕获细胞的帽盖于预先加有200μl Trizol试剂的0.5mlEppendoff管上,倒置离心管,室温静置30min,加40μl氯仿剧烈振荡15秒后室温静置15min,离心4℃11000转15min,将上清液移至另一新管加100μl异丙醇混匀,-70℃放置30min后离心4℃11000转10min,弃上清,加入75％DEPC乙醇200μl漂洗,离心4℃11000转5min,弃上清空气干燥15min,沉淀溶于经DEPC处理的去RNA酶水中,55℃水浴中孵育10min,所得样品置-70℃保存.3.cDNA第一链的合成(RT-PCR):PCR热循环仪中应用锚定引物-T7(dT12)AP9,T7(dT12)AP12,分别合成原发癌和淋巴结转移癌的cDNA第一链.4.PCR(DD-PCR):以逆转录合成的cDNA第一链为模板,用锚定引物-TMR-T7(dT12)AP9,TMR-T7(dT12)AP12和随机引物M13r-ARP1-4进行PCR扩增,反应条件:95℃2min预变性,92℃15S变性,50℃30S复性,72℃2min延伸共4个循环,92℃15S变性,60℃30S复性,72℃2min延伸共30个循环.5.差异条带回收及再扩增DDRT-PCR产物在Genomyx LR DNA电泳系统中以3000V,100W,55℃电泳4h.Genomyx SC荧光扫描分析系统采集并分析图象,选择差异表达的电泳条带,在切胶工作台上切取差异条带并回收DNA片段.切下的凝胶放入1.5ml离心管中,加入50μl无菌无核酶的TE液,37℃水浴60min后,-20℃待用.以4μl此TE液为模板,T7 Promoter及M13 Reverse为引物,反应体系同前,对回收的DNA片段进行再扩增.6.纯化及序列分析再扩增DDRT-PCR产物进行1％琼脂糖电泳,切取再扩增出的胶带,于提纯离心管中离心12000g 15min,得到的纯化DNA片段送测序.结论:1.小细胞肺癌原发癌和淋巴结转移癌在基因表达方面存在差异.2.该研究筛选的两个cDNA片段是否为小细胞肺癌的转移相关基因,尚需进一步验证.

目录

英文缩略语

1.前 言

2.实验材料

3.实验结果(附表附图)

4.讨 论

5.结 论

本研究新见解

参考文献

致 谢

综 述

个人简介