应用PCR-SSCP银染检测脑胶质瘤中LGI1基因突变

摘要

研究背景Chernova等人于1998年从胶质母细胞瘤细胞系T98G染色体10q24区域分离出一个新的基因，该基因在多型胶质母细胞瘤中杂合性缺失(LOH)高达80％以上，它编码一种富含亮氨酸重复序列(LRRs)的蛋白质。初步研究提示，该基因在神经组织中能高度特异性的表达，在低级别胶质瘤中表达降低，在恶性胶质瘤细胞中表达明显降低，甚至消失，具有肿瘤抑制基因的特性，故将其命名为富亮氨酸胶质瘤失活基因1(Leucinerichgene-GliomaInactivated1，LGI1)。该基因是继PTEN后新近才发现的候选的抑癌基因，关于该基因的研究尚未成为热点，目前多数研究与颞叶癫痫的发病有关，与脑肿瘤有关的研究相对较少，该基因的生物学作用机制尚不明确。国内未见该基因的研究报告。 目的为了检测人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系LGI1基因编码区中有无碱基突变，并探讨LGI1基因突变在胶质瘤发生、进展过程所起的作用。 材料与方法收集12例天津市环湖医院、天津市第一中心医院手术切除的新鲜胶质瘤标本，1例正常脑组织标本；体外培养TJ905、SK-N-SH、A172、U251、H45种脑胶质瘤细胞系。提取组织标本及培养细胞基因组DNA。设计特异性引物分别扩增LGI1各外显予序列，采用SSCP银染分析，发现异常泳动条带进行DNA序列分析。 结果1、琼脂糖凝胶电泳检测证实在胶质瘤组织标本、细胞系及正常脑组织均克隆出完整的与预期片段一致的LGI1外显子序列。 2、琼脂糖凝胶电泳未检测到胶质瘤细胞系SK-N-SH第1外显子处扩增产物，推测其在此处发生了基因缺失。 3、未在12例胶质瘤标本中检测到SSCP银染异常条带。 4、在细胞系TJ905第5外显子处检测到电泳条带异常，经DNA测序分析证实确有突变，突变位点位于第5外显子的第7(TCT→TCC)、第9(GAC→AAC)、第10(CTC→CCC)、第13(GAT→AAT)以及第18(CTG→CGG)密码子。 结论未在脑胶质瘤标本中发现LGI1基因编码区突变，仅在胶质瘤细胞系TJ905LGI1第5外显子检测到突变。基因突变可能不是LGI1在胶质瘤恶性进展过程中失活的主要原因；LGI1与胶质瘤之间的关系尚待进一步研究。

目录

文摘

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第一章引言

第二章实验材料与方法

第一节材料

2.1.1组织标本

2.1.2胶质瘤细胞系来源

2.1.3细胞培养基及溶液

2.1.4细胞及组织DNA提取相关试剂

2.1.5 PCR扩增试剂盒

2.1.6琼脂糖电泳相关试剂及液体配制

2.1.7 SSCP分析相关试剂及液体配制

2.1.8主要的设备仪器

第二节方法

2.2.1 TJ905、SK-N-SH、A172、U251、H4细胞系的培养

2.2.2TJ905、SK-N-SH、A172、U251、H4细胞系的冻存

2.2.3 TJ905、SK-N-SH、A172、U251、H4细胞系的复苏

2.2.4 TJ905、SK-N-SH、A172、U251、H4培养细胞系DNA的提取

2.2.5冰冻胶质瘤标本DNA的提取

2.2.6 DNA定量

2.2.7 LGI1外显子的PCR扩增

2.2.8 SSCP银染分析

2.2.9 DNA测序

第三章实验结果

第一节LGI1外显子序列片段PCR扩增产物

第二节SSCP银染分析

第三节DNA测序

第四章讨论

第一节LGI1基因突变与疾病

4.1.1 LGI1与ADPEAF

4.1.2 LGI1与胶质瘤

第二节结果影响因素分析

4.2.1检测标本中未发生LGI1突变

4.2.2模板DNA的问题

4.2.3 PCR反应对结果的影响

4.2.4 SSCP银染分析出现假阴性

4.2.5 DNA序列分析未检测出突变

4.2.6存在其它的导致基因失活的原因

第三节问题与展望

4.3.1本实验的不足之处

4.3.2实验展望

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历

综述 LGI1与胶质瘤关系之研究现状