冬虫夏草蛋白质组的初步研究

摘要

冬虫夏草[Cordycepssinensis(Berk)Sacc.]，又名虫草、冬虫草、夏草冬虫，是麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)的一种虫生真菌(中国被毛孢为其无性阶段)。冬虫夏草具有补肾、免疫调节等多种药理作用，长期以来一直被视为珍贵的中药和藏药，享誉全世界，特别在东南亚地区影响广泛。 虫草需要在我国西部地区(西藏、青海、甘肃、新疆)特殊的生态环境下才能生长。因此，天然虫草资源极为短缺，每公斤售价高达3万元以上。虽然虫草菌丝早已实现人工培养，并可获得发酵产物，但其售价远不如天然虫草(售价只有几十元/公斤)。尽管蝙蝠蛾幼虫和虫草菌丝的人工培养均已获得成功，并实现了在人工条件下诱导中国被毛孢与蝙蝠蛾幼虫寄生形成完全相同的的天然虫草体。但虫草的这些药用价值的具体机理大多数都还未进行过深入研究。因此也就还无法判断菌丝体是否不需要经过对蝙蝠蛾幼虫的特异性寄生就能具有和天然虫草完全相同的药理功能。 本研究首先对中国被毛孢的液体培养条件进行摸索，确定菌丝体大量生长的较适培养基。然后利用蛋白质组学(Proteomics)研究技术手段，对天然虫草和虫草菌的蛋白质表达图谱进行系统研究，对其整体蛋白质组分进行分离、比较和鉴定，建立虫草蛋白质凝胶指纹图谱。采用Edman微量测序技术，对用双向凝胶电泳分离出来的差异位点蛋白质，进行氨基酸序列分析；并根据虫草蛋白质基本数据资料(等电点和分子量)，进行数据库检索分析。 本研究最终得出了中国被毛孢的较适培养基为：2％蔗糖、1％蛋白胨、1.5％酵母膏、0.275％葵瓜子油、pH为5.5(加一定量的无机盐)。此培养基可以使中国被毛孢菌丝体干重达到5.42g/L。 将天然虫草和中国被毛孢的双向电泳图谱比较发现，天然虫草仅检出18个蛋白点，而中国被毛孢则有188个蛋白点。这可能是由于中国被毛孢菌丝体的蛋白质是从鲜活的菌丝体提取，而天然虫草的蛋白质是从干固的虫草提取，其在形成虫草的过程中可能造成大量的蛋白质损失或被破坏。虽然在天然虫草双向电泳图谱中分离出的蛋白点较少，却发现了4个虫草菌双向电泳图谱不存在的蛋白点。这些差异蛋白质很显然是虫草菌寄生到蝙蝠蛾幼虫后才产生的，这可能是虫草菌在寄生蝙蝠蛾幼虫过程中形成的特殊产物，对其深入分析可能对揭示二者之间特异性寄生关系及对于分析天然虫草的特殊药理作用具有重要意义。此外对天然虫草与中国被毛孢的双向电泳图谱进行分区分析。结果表明中国被毛孢的蛋白大部分集中在14.4-43.3kD、pH5-7的区域内；天然虫草蛋白集中在分子量14.4-43kD、pH3-5区域内。 本研究重点选择了其中一个蛋白点进行了N末端氨基酸序列测定，测定的10个氨基酸序列为Val-Gly-Asn-Ala-Arg-Val-Val-Asn-Asn-Cys。经数据库检索发现，其N末端的10个氨基酸序列与hypotheticalproteinAN8043.2、putativefimbrialusher、UDP-N-acetylglucosaminepyrophosphorylase等都具有较高的相似性。

目录

文摘

英文文摘

南开大学学位论文版权使用授权书和原创性声明

第一章前言

第一节冬虫夏草的研究进展

1.1.1生物学特性

1.1.2冬虫夏草菌侵染寄主幼虫的研究

1.1.3冬虫夏草的分离鉴定

1.1.4冬虫夏草的人工培育

1.1.5冬虫夏草菌丝体的液体深层发酵

1.1.6冬虫夏草的化学成分和药理作用

1.1.7冬虫夏草的研究趋势

第二节蛋白质组研究进展

1.2.1蛋白质组研究技术及应用

1.2.2双向凝胶电泳(2-DE)技术

1.2.3主要的蛋白质分析技术

第三节本研究的目的和意义

第二章材料和方法

第一节实验材料

2.1.1菌种

2.1.2试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4培养基

第二节实验方法

2.2.1中国被毛孢的人工培养

2.2.2蛋白质的提取

2.2.3等电聚焦电泳

2.2.4凝胶的平衡

2.2.5 SDS-PAGE电泳

2.2.6银染

2.2.7转膜

2.2.8差异蛋白N末端氨基酸序列的测定

2.2.9差异蛋白的同源性检索

第三章结果和分析

第一节中国被毛孢的培养结果与分析

3.1.1中国被毛孢在固体培养基上的生长情况

3.1.2中国被毛孢液体培养条件的研究结果与分析

第二节中国被毛孢菌丝体与天然虫草总蛋白的双向电泳图谱比较

第三节差异蛋白的同源性检索

3.3.1差异蛋白N末端氨基酸序列的测定

3.3.2差异蛋白的同源性分析

第四章讨论

第一节中国被毛孢的培养

4.1.1中国被毛孢在固体培养基上的生长

4.1.2中国被毛孢的液体培养条件

第二节双向电泳中各环节对实验结果的影响

4.2.1总蛋白质的提取

4.2.2上样量

4.2.3等电聚焦电泳

4.2.4等电聚焦后凝胶的平衡

4.2.5 IEF管胶的转移及封固

4.2.6 SDS-PAGE电冰

4.2.7染色

第三节中国被毛孢与天然虫草双向电泳结果的比较

第五章结论

致谢

参考文献

个人简历