生物传感技术对活血化瘀中药有效成分作用机理的研究

摘要

亲和型生物传感器以其灵敏度高、响应快、特异性强、样品无需标记等优点越来越受到研究者的重视。本论文主要研究工作是通过不同的表面修饰技术，利用亲和型生物传感器构建了可应用于基于细胞因子和受体相互作用的中药有效成分作用机理研究的亲和型生物传感技术，并将其应用于活血化瘀中药有效成分赤芍801作用机理的研究中。论文的主要内容概括如下： 1.可应用于中药有效成分作用机理研究的亲和型生物传感技术——IAsys和QCM生物传感技术的构建及其在赤芍801作用机理研究中应用的可行性和可信性。 利用生物素-亲和素系统和自组装膜技术，将sTNFR-I固定于IAsys样品池和QCM基片表面，结合IAsys和QCM两种亲和型生物传感器，检测sTNFR-I与TNF-α的特异性相互作用，以此为基础构建了可应用于基于细胞因子和受体相互作用的中药有效成分作用机理研究的亲和型生物传感技术。实验结果表明：两种方法均可有效地将sTNFR-I固定在传感器的敏感表面上，而且sTNFR-I在样品池表面的固定化效果与sTNFR-I溶液浓度相关，12mg/L是sTNFR-I在IAsys样品池和QCM基片表面固定化的最适浓度。TNF-α可与固定于IAsys样品池和QCM基片表面的sTNFR-I发生特异性结合。重复性和可信性实验表明：构建的IAsys和QCM两种亲和型生物传感技术在TNF-α与sTNFR-I特异性相互作用研究中的相对标准差(RSD)分别是2.12％和5.76％。证明该方法可以应用于基于细胞因子和受体相互作用的中药有效成分作用机理研究，而且具有很高的可行性和可信性。 2.IAsys和QCM生物传感技术对活血化瘀中药有效成分赤芍801作用机理的研究。 应用构建的IAsys和QCM两种亲和型生物传感技术对TNF-α和sTNFR-I之间的特异性相互作用进行实时监测，对TNF-α和sTNFR-I之间相互作用的动力学进行分析，并在此基础上研究赤芍801、阿魏酸和川芎嗪对TNF-α和sTNFR-I相互作用的影响，以探讨赤芍801的体内靶点和作用机理。实验结果表明：TNF-α可与固定于样品池表面的sTNFR-I发生浓度依赖性、特异性、快速结合，并经FASTfit分析，计算反应的动力学参数，亲和常数KD=～10-7M，KA=～106M-1。赤芍801可增强其相互作用，增加TNF-α和sTNFR-I的亲和力，使其相互作用的亲和常数KD由～10-7M提高至～10-8M。并具有浓度依赖性。揭示了TNF-α与sTNFR-I的相互作用可能是赤芍801发挥其药理学作用的体内调控靶点之一。实验结果还证明：阿魏酸和川芎嗪对TNF-α和sTNFR-I之间的结合反应无明显影响。分别将应用两种不同的表面修饰技术构建的IAsys和QCM生物传感技术应用于赤芍801作用机理的研究，不仅成功地完成了对TNF-α和sTNFR-I相互作用的实时监测和动力学分析，且两种方法取得了高度一致性的实验结果，更进一步证实了该方法的科学性和可靠性。 对传感器敏感表面的再生及使用寿命进行了研究，TNF-α结合至表面后可用10mMHCl洗脱其与sTNFR-I的结合，再生得到sTNFR-I包被的样品池表面，可重复使用。且生物素样品池还可用饱和KOH洗脱其表面结合的全部蛋白，用于不用的实验观察。通过再生，样品池可重复利用，降低成本。样品池在包被配基后一周内可保持较高的配体结合活性，可用于长期检测。 3.IAsys和QCM生物传感技术在活血化瘀中药有效成分赤芍801作用机理研究中的比较 应用生物素-亲和素系统和自组装膜表面修饰技术均可有效将sTNFR-I固定于传感器敏感表面以用于与TNF-α的相互作用分析。且两种修饰方法在传感器敏感表面固定sTNFR-I的量，在sTNFR-I溶液浓度相同时差异很小。CMD样品池由于不需要预先将sTNFR-I进行生物素标记处理等，从而简化了操作。且能达到应用生物素-亲和素系统同样的固定sTNFR-I的效果。但由于通过CMD表面的羧基与蛋白的氨基键合而将蛋白质配基固定于样品池表面，以固定的配基难于在不破坏CMD表面的情况下彻底洗脱，因而不能再用于固定不同的配基；而生物素样品池在使用中由于配基蛋白质不直接与样品池表面结合，在一定条件下可以被洗脱。因此同一生物素样品池可以重复利用，用于固定不用的配基蛋白。 在实际应用中，QCM和IAsys均具有较高的重复性，QCM对144nMTNF-α与sTNFR-I的结合5次重复检测的RSD=5.76％和8.56％，IAsys对144nMTNF-α与sTNFR-I的结合5次重复检测的RSD=2.12％和1.49％，说明IAsys检测的重复性优于QCM。且由于检测原理的不同，IAsys检测的响应速度比QCM更快。 本研究以临床常用及现代药理学研究证实的有效的活血化瘀中药有效成分赤芍801等作为切入点，应用不同的表面修饰技术，结合IAsys和QCM生物传感技术构建了一种可应用于基于TNF-α和sTNFR-I相互作用的中药有效成分作用机理研究的简单、快速、可靠的研究方法，并将其应用于活血化瘀中药有效成分赤芍801作用机理的研究中。不仅有助于阐明TNF-α/sTNFR-I的生物学意义和活血化瘀中药有效成分作用的分子机理，并可用于TNF-α/sTNFR-I系统拮抗剂的快速筛选，以及可以此为基础构建中药作用机理研究的示范性研究平台。

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

第二章基于IAsys生物传感技术的活血化瘀中药有效成分作用机理的研究方法的构建

第三章应用IAsys生物传感技术对活血化瘀中药有效成分作用机理的研究

第四章基于石英晶体微天平的活血化瘀中药有效成分作用机理的新型研究方法的构建

第五章应用QCM技术对赤芍801作用机理的研究

第六章IAsys和QCM方法对赤芍801等作用机理研究的比较

第七章结论

致谢

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果