RNAi靶向沉默AFP对人HepG2细胞株细胞增殖及周期相关基因表达的影响

摘要

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是哺乳动物的一种重要胚胎蛋白，出生后其血清浓度迅速下降，正常情况下，成人中AFP的合成被抑制。自四十年前在血清中被发现以来，AFP一直被视为肿瘤标志物的黄金标准。作为肿瘤相关胚胎蛋白，人们对AFP进行了纯化、鉴定、克隆以及测序用于临床诊断。然而，人们对AFP调节肿瘤生长的生物学作用关注较少。直到近十年，研究学者们才认识到AFP这方面的生物作用，并开始对其进行研究。目前，研究学者们一致认为AFP对肿瘤生长的调节作用是通过细胞表面AFP受体介导的内吞作用实现的。放射自显影报道以及AFP在抗癌药物轭合物方面的应用都证明该胚胎蛋白可以被细胞内吞。AFP及其多肽片段作为生长反应修饰剂具有重要的应用，例如凋亡G蛋白偶联的信号转导，基因治疗，疫苗以及癌症预防。虽然人们对AFP的理化以及免疫学特性进行了大量的研究，然而其在胚胎发育以及成人癌症发生过程中的作用及机制仍然不清楚。 为了研究AFP对体外培养肝癌细胞系的增殖作用，我们设计了小干扰RNA(siRNA)，通过Biotex质脂体转染试剂将优化后的shRNA表达质粒转入人肝癌细胞HepG2细胞株，并以未转染的．HepG2细胞株及空质粒转染的HepG2细胞株作为对照。通过RT-PCR的方法在mRNA水平上检测AFP的沉默效果，MTT法检测AFP基因沉默对细胞增殖的抑制作用，流式细胞技术分析AFP基因沉默对细胞周期的影响。实验结果发现AFP沉默对体外细胞生长具有明显的抑制作用，与空质粒转染的HepG2细胞相比，AFP沉默的人肝癌细胞HepG2细胞株细胞增殖能力受到抑制。AFP沉默的：HepG2细胞S期分布比率由17.67％提高到38.56％，而G(2)/M期分布比率下降。通过半定量PCR(semiquantitivepolymerase chain reaction)法发现AFP沉默后的HepG2细胞促凋亡基因内bax表达量上调而抑凋亡基因bcl-2表达量下降。 同时，我们还通过流式细胞技术，以及mRNA水平上检测周期相关基因研究了AFP沉默与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)，干扰素-α(interferon-alpha，IFN-α)以及地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)药物处理的协同作用。我们发现AFP基因沉默促进了药物对细胞周期的阻滞作用，并发现AFP基因沉默与药物协同作用后，促凋亡基因内bax表达量上调，抑凋亡基因bcl一2表达量下降，同时与细胞周期相关的基因cyclinD和p21表达量上调。AFP基因沉默有效地抑制了人肝癌细胞HepG2细胞株的增殖，并对细胞周期的分布产生显著影响。然而，AFP对肝癌细胞增殖作用的机制以及作为新的癌症治疗方法的AFP siRNA技术与抗癌药物的联合应用，仍需要进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节AFP的发现和结构

1.1.1 AFP的发现

1.1.2 AFP的结构

第二节AFP的生物学功能

1.2.1结合疏水配体

1.2.2免疫抑制作用

1.2.3调节细胞增殖以及肿瘤细胞的生长

第三节AFP的表达与调控

第四节AFP多肽分子及应用

第五节AFP的应用

1.5.1应用AFP抗体治疗癌症

1.5.2 AFP作为抗癌药物的轭合物

1.5.3AFP基因的启动子用于癌症的治疗

第六节本实验研究的意义和特色

第二章材料和方法

第一节材料和试剂

2.1.1实验室材料和设备

2.1.2常用试剂的配制

第二节实验方法

2.2.1细胞复苏

2.2.2细胞冻存

2.2.3 AFP基因RNA干扰靶序列的选择

2.2.4合成的两条寡核苷酸与线性化siSTRIKETM U6 Hairpin质粒进行连接、扩增和质粒的鉴定

2.2.5测序

2.2.6超纯质粒的制备

2.2.7转染条件的优化

2.2.8转染流程

2.2.9 HepG2细胞总RNA的提取

2.2.10药物处理细胞

2.2.11总RNA的逆转录

2.2.12 PCR反应循环参数的优化

2.2.13针对人AFP基因构建的shRNA表达载体对HepG2细胞AFP表达抑制的RT-PCR验证

2.2.14半定量PCR

2.2.15MTT法测定药物及人AFP表达被抑制后对HepG2细胞增殖的影响

2.2.16流式细胞仪检测AFP表达被抑制后对细胞周期和凋亡的影响

第三章结果与分析

第一节shRNA表达质粒的构建以及酶切鉴定结果

3.1.1质粒图谱

3.1.2质竝酶切鉴定结果

第二节测序结果

第三节HepG2 RNA的提取

第四节循环参数的优化

第五节肝癌细胞HepG2培养

第六节MTT法检测药物及AFP基因沉默对人肝癌细胞HepG2细胞株增殖情况的影响

第七节转染优化

第八节流式细胞技术分析转染以及药物处理对HepG2细胞周期的影响

3.8.1流式细胞技术分析细胞周期变化

1.8.2流式细胞数据统计

3.8.3流式细胞技术分析AFP沉默对HepG2细胞凋亡情况的影响

第九节基因差异表达

3.9.1基因差异表达电泳图片

3.9.2基因差异表达数据统计

第四章讨论

第一节影响RNA干扰效率的因素

4.1.1目标基因干扰靶序列的选择及有效siRNA的设计

4.1.2转染条件的优化

第二节半定量PCR

4.1.3半定量PCR相关概念

4.2.2两种非竞争PCR方法

第三节AFP在细胞周期调控和凋亡机制中的作用

第四节针对AFP的RNAi对AFP生物学功能研究的意义

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果