生产可降解塑料的基因工程菌的构建

摘要

聚β-羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)是一种由微生物合成的聚酯,由于具有生物可降解性、生物相容性、光学性、压电性、气体相隔性等许多优良性能,而有可能在众多领域,如生物降解性包装材料、组织工程材料和缓释材料等方面得到广泛应用,因此正日益引起了科研领域及工业界的广泛兴趣。 本文用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中合成聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)的三个关键酶--β-酮硫裂解酶基因phbA、依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)和PHB合成酶基因(phbC),成功构建了含有phbA的表达载体并转入巨大芽孢杆菌中进行表达,旨在提高PHB产量降低成本。论文取得了如下研究成果： (1)从GeneBank中查询了关于真养产碱杆菌中phbA、phbB、phbC基因的序列,设计了PCR引物,以真养产碱杆菌中提取的总DNA为模板,采用PCR扩增法克隆出phbA、phbB和phbC三段基因。 (2)选用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒,成功构建了含有phbA的表达载体,并转入巨大芽孢杆菌中进行表达。 (3)用菌落直接PCR法鉴定了重组质粒。 (4)摇瓶发酵研究表明,重组巨大芽孢杆菌可以利用葡萄糖、果糖、可溶性淀粉和丁酸等多种碳源合成PHB,且细胞干重与PHB百分率都有了大幅度提高。重组巨大芽孢杆菌可以利用可溶性淀粉等廉价底物,进一步降低PHB的生产成本,也可以把丁酸作为PHB合成的前体,提高PHB的产量。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节普通塑料及其对环境的危害

第二节可降解塑料简介

第三节PHB的组成、性质、降解和应用

1.3.1 PHB的组成和性质

1.3.2 PHB的降解

1.3.3 PHB的应用

第四节PHB的生产

1.4.1 PHB的细菌发酵生产

1.4.2转基因植物合成PHB

1.4.3使用农业或食品废物(水)合成PHB

第五节PHB产生菌和转化基质

第六节PHB的合成途径及关键酶的基因克隆

第七节国内外利用基因工程菌生产PHB现状

第八节PHB的发展前景和趋势

第九节对受体菌巨大芽孢杆菌的研究

1.9.1巨大芽孢杆菌概述

1.9.2巨大芽孢杆菌菌株形态和生理生化特征

1.9.3巨大芽孢杆菌在表达外源基因中的优点

第十节本论文研究目的、意义和技术路线

1.10.1研究目的和意义

1.10.2研究技术路线

第二章实验材料与方法

第一节材料

2.1.1菌种与质粒

2.1.2常用酶和生化试剂

2.1.3试剂盒、缓冲液和DNA标准物

2.1.4仪器和设备

第二节实验方法

2.2.1培养基的配制及菌种保存

2.2.2真养产碱杆菌基因组DNA的制备

2.2.3 DNA电泳测定

2.2.4目的片断的PCR扩增

2.2.5大肠杆菌-芽孢杆菌梭粒pHY300LK的提取

2.2.6酶切反应及载体与目的片段的连接

2.2.7表达载体pHY300PLK-phbA转入巨大芽孢杆菌

2.2.8重组质粒菌落的鉴定

2.2.9发酵培养及PHB的提取

第三章实验结果与分析

第一节PHB基因的克隆

3.1.1 PCR模板的获得

3.1.2目的片段的PCR扩增结果

第二节目的基因与载体的连接、转化和鉴定

3.2.1大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK的提取

3.2.2重组质粒pHY300PLK-phbh的构建

3.2.3表达载体pHY300PLK-phbh转入巨大芽孢杆菌

3.2.4重组子质粒的筛选

3.2.5菌落直接PeR鉴定

第三节发酵培养和PHB提取

3.3.1 PHB颗粒检测

3.3.2重组巨大芽孢杆菌对不同碳源的利用情况

第四章结论与展望

第一节结论

第二节展望

参考文献

致谢

附录

个人简历