利用RNA干扰技术获得水稻生育酚缺失突变体的研究

摘要

生育酚是一类仅能在植物、藻类等光合生物体内合成，为人体和动物所必需的维生素E重要组分。作为一种重要的脂溶性抗氧化剂，生育酚的抗氧化功能已经在体外模型和动物体内得以证实，但其在植物体内的具体功能还不是完全清楚。近年来研究显示，生育酚还具有抗氧化作用以外的其他更为重要功能。为了进一步研究植物体内生育酚的生理功能，我们选择水稻为材料，利用RNA干扰获取叶片生育酚合成抑制甚至缺失的突变体，为全面认识生育酚的功能奠定基础。本研究构建了水稻生育酚环化酶基因RNA干扰表达载体，并通过农杆菌介导转化水稻成熟胚来源的愈伤组织。经过组织培养再生，获得抗性再生植株。利用HPLC方法测定叶片中生育酚的含量，并对生育酚合成抑制程度不同的植株进行表型和生理特性分析。主要研究内容及结果如下：
　　 ⑴生育酚环化酶基因RNA干扰表达载体的构建：提取水稻总RNA，以特异性引物RT-PCR，扩增得到500 bp大小的基因干扰片段。通过设计的两组双酶切，分别正向、反向连入中间载体pSTARLING质粒的cre内含子两侧，构建RNA干扰表达盒。通过Not I酶切，将该表达盒插入到植物双元表达载体pWbvec8的Not I位点上，成功构建了RNA干扰表达载体。
　　 ⑵农杆菌介导的水稻遗传转化：冻融法将表达载体质粒转化进入农杆菌LBA4404中，用于侵染由水稻成熟胚来源的愈伤组织。确定较为合适的侵染条件为：农杆菌菌液浓度OD600为0.5，侵染时间20 min。经过3 d共培养后，进行两轮的潮霉素抗性筛选，共获得抗性再生愈伤组织块93个，抗性再生率为18.1％。后经预分化和分化培养，共获得抗性植株78株，移栽温室土壤培养成活57株。
　　 ⑶抗性植株生育酚含量测定及表型、生理特征分析：利用HPLC方法分析57株抗性植株叶片生育酚的含量，证实全部再生植株均为阳性。与野生型植株叶片生育酚含量相比，抗性植株体内含量在0.1％～75％。其中生育酚合成抑制程度较高，含量仅为野生型5％以下的植株有30株，约占总体的52.6％。对RNA干扰植株的株高，光合速率，光合色素等生理指标进行了测定，结果发现生育酚缺乏导致了植株生长明显延缓和光合速率下降，但对光合色素的含量及组成影响不大。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

第一节 生育酚简介

1.1.1 生育酚的结构及分类

1.1.2 天然生育酚的应用

第二节 植物体内生育酚的合成代谢途径及生物学功能

1.2.1 生育酚在植物体内的分布及其合成途径

1.2.2 生育酚在生物体内的抗氧化功能

1.2.3 细胞内信号调控功能

1.2.4 叶片韧皮部装载过程中功能

1.2.5 调节内质网途径的脂肪酸代谢

第三节 RNA干扰技术简介

1.3.1 RNA干扰现象的发现及其分子机制

1.3.2 RNA干扰技术在功能基因组研究上的应用

第四节 水稻遗传转化体系

1.4.1 水稻的遗传转化技术

1.4.2 水稻的组培再生技术

第五节 研究目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌株和植物材料

2.1.2 载体

2.1.3 引物

2.1.4 试剂及培养基

2.1.5 仪器

第二节 实验方法

2.2.1 生育酚环化酶(TC)基因干扰载体的构建

2.2.2 根癌农杆菌的转化及重组子筛选

2.2.3 水稻组织再生体系以及农杆菌介导的遗传转化

2.2.4 抗性再生水稻植株叶片生育酚含量的HPLC检测

2.2.5 转基因植株表型特征和生理指标的测定

第三章 结果与分析

第一节 生育酚环化酶(TC)基因干扰载体的构建

3.1.1 TC干扰片段的RT—PCR扩增

3.1.2 重组质粒pMD18—T—TC的鉴定

3.1.3 TC干扰片段测序结果

3.1.4 TC干扰片段正向插入重组质粒pS—TC的鉴定

3.1.5 中间表达载体pS—TC—TC’的鉴定

3.1.6 最终表达载体pWbvec8—TC—TC’重组质粒的鉴定

3.1.7 根癌农杆菌的转化及重组子筛选

第二节 水稻组织再生体系以及农杆菌介导的遗传转化

3.2.1 水稻愈伤组织的诱导和侵染

3.2.2 水稻愈伤组织的抗性筛选和分化

3.2.3 抗性再生植株的生根培养及土壤栽培

第三节 水稻转基因植株叶片生育酚含量的测定以及表型

3.3.1 水稻转基因植株叶片生育酚含量的检测

3.3.2 水稻RNA干扰植株表型及生理指标的测定

第四章 讨论

小结

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文