用于生物传感器的氧化还原酶蛋白固定化技术研究

摘要

生物大分子如何被持久、高效并保持活性状态固定在生物传感表面,同时保证生化反应信号迅速而充分地被信号转换元件所采集,是生物传感器研究的重要课题。氧化还原酶类催化底物分子的氧化还原反应,反应过程中转移的电子可被电化学检测仪器捕获,或者产生颜色变化可通过紫外-可见分光光度计来检测,易于获得可定量测定的信号变化,因而适合充当生物传感器的分子识别元件,并作为量化评价酶固定化效果的模式分子。
　　 本论文选择三种在生物传感器中广泛应用的氧化还原酶蛋白:胆碱氧化酶(ChOx)、葡萄糖氧化酶(Gox)和辣根过氧化物酶(HRP)来研究两类蛋白质固定化技术,分别为疏水蛋白自组装薄膜固定化ChOx和Gox,以及聚电解质层层累积微胶囊固定化HRP。
　　 疏水蛋白是一类由丝状真菌产生的外分泌蛋白,包含约100个氨基酸残基。其分子的表面结构包括一个4 nm2大小的平整的连续疏水区域,其余部分为亲水性,是一个典型的两亲性分子,具有极强的界面活性,能够显著降低水的表面张力,并在多种表面自组装形成高度有序的纳米级结构薄膜,同时改变表面对水的湿润性,帮助真菌在多种环境条件下完成表面吸附或冲破水面生长。根据氨基酸序列疏水模式及蛋白质生物物理特点的差异,疏水蛋白分为Ⅰ型和Ⅱ型,本论文研究了来源于瑞氏木霉Trichoderma reesei的Ⅱ型疏水蛋白HFBI在金属表面的自组装行为,及其用作电流型生物传感器的酶固定化基质的可行性,致力于构建完全由蛋白质修饰、能够最大程度利用固定化酶的催化活力的酶电极。
　　 石英晶体微天平(QCM)实验结果证实了HFBI在铂表面的自组装行为,并显示HFBI自组装量受酸碱度影响不明显,而随HFBI浓度增加呈非线性增长。通过循环伏安法检测铂电极表面HFBI自组装薄膜的通透性,验证了QCM实验结果,即浓度较高的HFBI溶液能够在铂表面自组装形成更为致密的疏水蛋白薄膜,表现为较高的蛋白质自组装量和较低的通透性。筛选出了适于构建生物传感器的适当HFBI浓度,由20μg/mL HFBI自组装形成的疏水蛋白薄膜,能够允许信号分子过氧化氢通过,同时有效屏蔽电活性干扰物质抗坏血酸、尿酸和醋氨酚到达电极表面。
　　 在生物传感表面构造亲水性微环境有利于酶蛋白保持活性构象,通过测定HFBI自组装薄膜修饰前后金表面与水的接触角变化,证明该薄膜能够显著而且稳定地提高金表面的亲水性。在HFBI自组装薄膜修饰的金表面通过物理吸附成功地固定化了ChOx,酶的表面覆盖率为3366 ng·cm-2,固定化后ChOx的最适pH值由游离酶的pH8.0转变为pH7.6,表观米氏常数.Kmapp为1.27 mM,与游离酶Km值接近。在+400 mV工作电位下,基于Au/HFBI/ChOx电极的胆碱生物传感器各项性能指标良好,最低检测限为0.01 mM(信噪比=3),线性范围0.01-1.0mM,灵敏度2184.06458 nA·mM-1,表现出抗干扰性能和较长的使用寿命,对酶活力的利用效率显著优于已报道的同类胆碱生物传感器。
　　 在HFBI自组装薄膜修饰的铂表面通过静电吸附成功固定化了Gox,酶的表面覆盖率为859 ng·cm-2,固定化后Gox的表观米氏常数Kmapp等于14.8 mM,略低于游离酶Km值。在+400 mV工作电位下,基于Pt/HFBI/Gox电极的葡萄糖生物传感器各项性能指标良好,最低检测限为0.12 mM(信噪比=3),线性范围0.5-20 mM,灵敏度0.29806μA·mM-1,表现出抗干扰性能和较长的使用寿命,对酶活力的利用效率显著优于已报道的同类葡萄糖生物传感器。
　　 本论文首次将Ⅱ型疏水蛋白应用于电流型生物传感器,获得了高性能的胆碱和葡萄糖生物传感器,并提供了两种基于疏水蛋白HFBI自组装薄膜的、简单高效的酶蛋白固定化策略。
　　 本论文还报道了一种操作流程简化、条件温和、能够稳定固定化酶蛋白的微胶囊制备技术。使用包含HRP并带有负电荷的碳酸钙微粒作为模板,通过带有相反电荷的两种聚电解质:聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)交替累积,在模板表面形成(PAH/PSS)5自组装薄膜,溶解模板后获得了形态大小均一、平均直径约6μm、分散度较好的HRP-(PAH/PSS)5微胶囊,50天内HRP向微胶囊外释放量维持在总固定化量的6％以内。应用紫外-可见分光光度法测定微胶囊对HRP显色底物的催化活性,30天内对邻苯三酚的催化活力降低不超过20%。所制备的微胶囊表现出一定程度的选择透过性,有可能在用于生物传感器构建时提高对底物的专一性,并屏蔽部分干扰物质,应用于酚类环境污染控制。