G250单克隆抗体修饰的肿瘤靶向非病毒基因载体研究

摘要

在基因治疗中，非病毒基因载体因为具有安全性高、免疫原性低等优点日益得到重视，而解决非病毒基因载体在基因转染过程中的靶向性是其重要研究内容。最常用的有效策略是以抗体或配体修饰非病毒基因载体，即将特定的抗体分子或配体分子与非病毒基因载体相连接形成偶联体，从而DNA能够在修饰后的非病毒基因载体的运载下转染到表达特定抗原或受体的细胞内，使DNA的转染具有高效的靶向性。
　　 为了开发出对肿瘤细胞具有高效基因转染效率的基因治疗载体，本研究以聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)为非病毒基因载体，以肾癌细胞和宫颈癌细胞高表达的G250抗原作为靶点，将G250单克隆抗体(G250mAb)和PEI-偶联，构建了G250靶向非病毒基因载体，并进行一系列靶向转染实验。在此基础上，采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)对靶向载体进行进一步修饰，改善其表面特性，提高非病毒基因载体在体内的基因转染效率。
　　 我们首先对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，制备腹水；通过辛酸一硫酸铵沉淀法和蛋白A琼脂糖亲和层析法纯化G250mAb，并经SDS-PAGE及免疫组织化学染色对抗体进行鉴定。然后将G250mAb与PEI或PEG修饰的PEI偶联，偶联后的产物经过葡聚糖凝胶G-75纯化，分别得到G250mAb-PEI靶向载体和G250mAb-PEI-PEG靶向载体。对靶向载体分别进行了凝胶阻滞、激光光散射等实验检测其作为基因载体的性质，并在表达G250抗原的肾癌细胞(Ketr-3)、宫颈癌细胞(Hela)和不表达G250抗原的肝癌细胞(HepG2)、肾癌细胞(ACHN)、血管平滑肌细胞(SMC)、成纤维细胞(NIH3T3)中进行了基因转染实验验证其转染的靶向性，此外还检验了血清浓度对基因转染效率的影响。同时，我们将表达小干扰RNA的质粒与靶向基因载体联合应用，检测其对肿瘤细胞生长的抑制作用。在体内实验中，我们采用裸鼠肿瘤模型检测靶向载体在体内的基因转染效率，基因转染实验分别采用流式细胞仪和化学发光检测仪测定基因转染效率。
　　 免疫组织化学染色结果表明绝化的G250mAb具有结合活性，可以与表达G250抗原的肿瘤细胞特异性结合。光散射和凝胶阻滞结果证明G250mAb-PEI能够与DNA形成纳米复合物，粒径分布较窄。同时PEI经过0250mAb修饰，提高了其生物相容性。流式结果显示G250mAb-PEI对G250抗原阳性细胞Ketr-3，Hela的转染效率明显高于未修饰的PEI，转染正常细胞SMC的效率比未修饰的PEI有所降低，对ACHN、HepG2的转染效率则没有太大的变化。这证明了G250mAb对载体的修饰，赋予了载体对G250抗原阳性细胞的靶向性。当存在游离的G250mAb时，G250mAb-PEI对Ketr-3的转染效率下降到对照组的水平，而游离的G250mAb对G250mAb-PEI和PEI转染SMC没有明显影响。这证明了基因载体的靶向性是通过G250抗原与抗体的相互作用所介导的。经过聚乙二醇(PEG)的进一步修饰后，靶向载体G250mAb-PEI-PEG对Hela细胞的转染效率可接近70％。虽然血清对基因转染效率有一定影响，随着血清浓度的增加，转染效率有所下降，但是G250mAb-PEI-PEG对于Hela细胞的转染效率在血清浓度30%的条件下仍显著高于其他细胞组。在体外治疗实验中，将G250mAb-PEI-PEG与pEGFP6-1-NS-Silencer质粒联合应用，可显著抑制Hela细胞的生长增殖。在裸鼠肿瘤模型中，G250mAb-PEI-PEG的体内转染效率也显著高于PEI和PEI-PEG。
　　 总之，G250mAb的修饰使PEI获得了对肿瘤细胞基因转染的靶向性，PEG修饰进一步提高了PEI在血清存在条件下的转基因效率，并能够与表达治疗基因的质粒联合应用有效地抑制肿瘤细胞的生长。在裸鼠肿瘤模型中，转染效率也得到了显著的提高，更加有利于非病毒基因载体体内基因治疗的开展。