常见侵袭性致病真菌检测基因芯片的研制

摘要

常见的侵袭性致病真菌是院内引起深部真菌感染的主要病原体,许多的疾病发生都与之有关,威胁着人类的健康,特别是那些具有免疫缺陷的病人。致病真菌快速而准确的检测与鉴定有利于有效的预防和控制病原菌感染。本课题的研究目的是建立一种利用寡核苷酸基因芯片对医院内常见的侵袭性真菌进行快速准确的鉴定,其检测范围菌株包括白色念珠菌、季蒙念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、克鲁斯念珠菌和新生隐球菌。
　　 我们通过对8种常见致病性念珠菌和新生隐球菌的间区序列进行比较和分析,确定在18SrDNA的末端和28SrDNA的前端选择通用引物,在5.8SrDNA内的保守区内设计正对照探针,而在间区可变区设计特异性探针。利用软件PrimerPremier5.0分别设计出9种致病性真菌的特异探针,同时设计了针对大部分真菌的阳性对照探针以及阴性对照探针,在不同的探针末端进行poly(T)加尾,利用poly(T)末端的氨基将探针固定在载玻片上,制成寡核苷酸基因芯片；提取真菌基因组后对间区序列进行PCR扩增,纯化扩增产物去除扩增引物,单独利用下游引物进行单链PCR扩增,在反义链中掺入Cy3-dUTP荧光标记,荧光标记后的扩增产物与寡核苷酸芯片上的探针发生杂交反应,通过洗涤,去除芯片上的非特异性杂交和吸附,然后用荧光扫描仪检测杂交信号。对检测体系进行了特异性、灵敏性实验。优化杂交条件,提高杂交效率。
　　 利用72株菌其中包括26株标准菌株和46株临床菌株分别参与了检测芯片探针的筛选和终型芯片性能评估。其中利用20株临床菌株进行了检测芯片的特异性评估,特异探针均显示了高度的特异性:该检测芯片对基因组的最低检测极限为10-2ng/μL。上述实验结果表明本课题利用寡核苷酸基因芯片技术所建立的检测方法具有准确、可靠、实用性强的特点,为医院中常见的深部真菌的快速检测鉴定,提供了一种新的方法和思路。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 研究背景简介

1.1.1 常见的侵袭性真菌及其检测方法

1.1.2 常见的侵袭性真菌基因组特点

1.1.3 常见的侵袭性真菌常规检测方法

1.1.4 侵袭性真菌的分子生物学检测

1.1.5 18S rRNA-28S rRNA基因间区(ITS)

1.1.6 18S rRNA-28S rRNA基因间区在真菌分类和鉴定中的应用.

1.1.7 基因芯片技术简介

1.1.8 基因芯片技术的种类

1.1.9 寡核苷酸芯片技术简介

1.1.10寡核苷酸芯片在微生物检测中的应用

1.1.11寡核苷酸芯片在致病性真菌检测鉴定中的应用

1.1.12寡核苷酸芯片在其他致病性病原体检测中的应用

1.1.13寡核苷酸芯片在其它领域中的应用

1.1.14基因芯片的发展趋势

第二节 研究目的、内容和创新性

1.2.1 研究目标

1.2.2 研究内容

第二章 材料和方法

第一节 主要实验材料和仪器

2.1.1 真菌菌株

2.1.2 引物和探针

2.1.3 试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 仪器

2.1.6 软件

第二节 实验方法

2.2.1 芯片检测范围的确定

2.2.2 菌株确认

2.2.3 特异探针的选择

2.2.4 引物探针的设计与制备

2.2.5 基因芯片的制备

2.2.6 真菌基因组的DNA的提取

2.2.7 基因芯片检测

2.2.8 基因芯片性能评价

2.2.9 芯片杂交液的研制

2.2.10单盲实验

第三章 结果与分析

第一节 真菌临床菌株的测序认定

3.1.1 测序结果

第二节 引物和探针的筛选

3.2.1 引物通用性评价

3.2.2 探针的筛选

3.2.3 基因芯片的点阵图

3.2.4 基因芯片的杂交图

第三节 检测方法的筛选和优化

3.3.1 扩增标记方法的选择

3.3.2 杂交系统的优化

3.3.3 芯片杂交结果

第四节 基因芯片性能评价实验

3.4.1 特异性实验

3.4.2 芯片检测灵敏度实验

3.4.3 单盲实验结果

第四章 讨论

4.1.1 PCR扩增靶序列

4.1.2 临床菌种的确认

4.1.3 探针的标记和检测

4.1.4 探针的设计与筛选

4.1.5 杂交系统

4.1.6 分子生物学方法对致病真菌的I临床研究

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历