线虫线粒体极长链脂酰CoA脱氢酶、烯脂酰fCoA水合酶和硫解酶的结构生物学研究

摘要

线粒体脂肪酸β氧化包括四步催化反应过程,通过这四步反应过程脂酰CoA的脂肪酸链被逐渐降解掉两个碳原子。参与这四步催化反应的酶类依次包括脂酰CoA脱氢酶、烯脂酰CoA水合酶、L-3-羟脂酰CoA脱氢酶以及硫解酶,这四步反应过程是:在线粒体脂肪酸β氧化第一步反应中,脂酰CoA脱氢酶催化脂酰CoA脂肪酸碳链α和β位之间的脱氢酶反应,生成反式-2,3-烯脂酰CoA；然后烯脂酰CoA水合酶催化反式-2,3-烯脂酰CoA的α和β位之间的水合反应生成L-3-羟脂酰CoA；在第三步反应中,L-3-羟脂酰CoA脱氢酶催化L-3-羟脂酰CoA的α和β位之间的再次脱氢反应,生成3-酮脂酰CoA；最后硫解酶将3-酮脂酰CoA降解成一个乙酰CoA分子和一个缩短两个碳原子的脂酰CoA。现已发现许多代谢性疾病与线粒体脂肪酸β氧化缺陷相关,例如代谢性酸中毒、高氨血症、脂肪肝以及糖尿病等。最近有关β氧化机制和缺陷治疗的研究越来越受到人们的重视,线虫是人类代谢疾病研究的一种良好的动物模型,但有关其线粒体β氧化的结构与功能的报道却很少。作者克隆表达了三种与线虫脂肪酸代谢相关的基因,这些基因分别是Y45F3A.3,C32E8.9和F53A2.7,根据WormBase数据库的信息,它们的表达产物分别为线虫极长链脂酰CoA脱氢酶、烯脂酰CoA水合酶以及硫解酶。作者将这三种基因克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌中大量表达,并分别纯化得到了高纯度的蛋白质样品。然后通过晶体生长条件的优化得到了高质量的蛋白晶体,利用日本光子工厂的BL5A线站和BL17A线站分别收集了这三种蛋白质晶体的高分辨率衍射数据,最终解析了线虫线粒体极长链脂酰CoA脱氢酶结合底物C11-CoA的晶体结构、线虫线粒体烯脂酰CoA水合酶的晶体结构和线虫线粒体硫解酶及其结合底物CoA的晶体结构。
　　 线虫极长链脂酰CoA脱氢酶的三维结构和静态光散射实验证明了该脂酰CoA脱氢酶具有独特的四聚体聚合状态,而现今发现的其他极长链CoA脱氢酶都不具有这一聚合状态,并且体外测活实验说明了线虫极长链脂酰CoA脱氢酶的四聚体结构正是其催化底物脱氢反应的活性状态。线虫极长链脂酰CoA脱氢酶结合底物C11-CoA的晶体结构以及体外测活的实验结果揭示了该脂酰CoA脱氢酶可改变底物结合位点的构象进而扩大底物结合口袋的空间以容纳具有更长脂肪酸碳链的底物。线虫烯脂酰CoA水合酶晶体的空间群为P21,晶胞参数为α=138.6,b=116.7,c=115.3(A),α=β=90.0,γ=124.0°。通过对于线虫烯脂酰CoA水合酶晶体衍射数据的分析,作者推测该晶体并非普通的“孪晶”而是由三套空间群均为P21的晶格系统组成的“三晶”。根据这一假设并借鉴“去孪”程序的原理,作者通过自行编写“去三晶”程序最终解析了该线虫烯脂酰CoA水合酶的晶体结构。静态光散射实验证明该线虫烯脂酰CoA水合酶具有不同于其他烯脂酰CoA水合酶的三聚体结构。线虫硫解酶是由分子量为43 kDa单体组成的同源四聚体结构,结构分析表明线虫硫解酶为合成硫解酶,对其野生型及其突变体的体外测活实验说明线虫硫解酶的四聚体结构是其催化乙酰乙酰CoA的降解反应所必需的。线虫硫解酶的四聚体状态是依靠亚基间129-143位铰链区的疏水相互作用维持,结构分析表明该铰链区的缺失导致线虫硫解酶结合底物的口袋进一步扩大,这有可能使线虫硫解酶的主要功能由合成硫解酶向分解硫解酶转变。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 线粒体脂肪酸β-氧化概述

1.1.1 脂肪酸的活化

1.1.2 脂酰CoA的转移

1.1.3 线粒体β-氧化循环

1.1.4 线粒体脂肪酸β-氧化的生理意义

1.1.5 线粒体脂肪酸β-氧化紊乱导致的相关疾病

1.1.6 线虫线粒体β-氧化的结构生物学研究的意义

第二节 极长链脂酰CoA脱氢酶

1.2.1 脂酰CoA脱氢酶家族

1.2.2 短链和中链脂酰CoA脱氢酶

1.2.3 长链脂酰CoA脱氢酶

1.2.4 极长链脂酰CoA脱氢酶

1.2.5 过氧化物酶体的脂酰CoA氧化酶简介

1.2.6 线虫线粒体极长链脂酰CoA脱氢酶的结构生物学研究的意义

第三节 烯脂酰CoA水合酶

1.3.1 烯脂酰CoA水合酶的功能

1.3.2 烯脂酰CoA水合酶的结构

1.3.3 线虫线粒体烯脂酰CoA水合酶的结构生物学研究的意义

第四节 硫解酶

1.4.1 硫解酶的功能

1.4.2 硫解酶的结构

1.4.2 线虫线粒体硫解酶的结构生物学研究的意义

第五节 本章小结

第二章 蛋白质晶体生长和相位问题

第一节 蛋白质晶体生长的原理与方法

2.1.1 蛋白质品体生长原理

2.1.2 蛋白质晶体生长方法

第二节 蛋白质晶体学的中心问题--相位问题

2.2.1 分子置换法(Molecular Replacement)

3.2.2 反常散射法(Anomalous Scattering)

第三章 线虫线粒体极长链脂酰CoA脱氢酶的结构生物学研究

第一节 实验方法

3.1.1 cVLCAD的基因克隆和重组蛋白序列分析

3.1.2 cVLCAD的表达与纯化

3.1.3 偶联多角度静态光散射的体积排阻凝胶层析实验(size exclusion chromatography with multiple multi-angle light scattering detection,SEC-MALS)

3.1.4 cVLCAD晶体生长条件的筛选与优化

3.1.5 cVLCAD晶体衍射数据的收集及处理

第二节 实验结果

3.2.1 cVLCAD的序列特点与相关性质

3.2.2 cVLCAD的表达纯化

3.2.3 cVLCAD聚合状态的确定

3.2.4 cVLCAD晶体生长条件的优化

3.2.5 数据处理

3.2.6 分子置换法结构解析

第三节 分析与讨论

3.3.1 cVLCAD单体结构描述

3.3.2 cVLCAD特殊的聚合状态

3.3.3 底物结合位点与催化功能

第四节 本章小结与展望

第四章 线虫线粒体烯脂酰CoA水合酶的结构生物学研究

第一节 实验方法

4.1.1 cECH的基因克隆和重组蛋白序列分析

4.1.2 母体cECH蛋白的诱导表达与分离纯化

4.1.3 偶联多角度静态光散射的体积排阻凝胶层析实验

4.1.4 cECH硒代甲硫氨酸蛋白衍生物(Se-cECH)的表达纯化

4.1.5 结晶条件的摸索

4.1.6 数据收集

第二节 实验结果

4.2.1 重组表达质粒的构建与重组蛋白序列分析

4.2.2 cECH与Se-cECH的分离纯化

4.2.3 cECH蛋白聚合状态的确定

4.2.4 晶体生长与晶体衍射

4.2.5 晶体衍射与数据处理

第三节 分析与讨论

4.3.1 cECH晶体是由三套空间群为P21的晶格组成的“三晶”

4.3.2 cECH结构解析

4.3.3 cECH的三维结构

第四节 本章小结与展望

第五章 线虫线粒体硫解酶的结构生物学研究

第一节 实验方法

5.1.1 cTHL的基因克隆和重组蛋白序列分析

5.1.2 cTHL蛋白的诱导表达与分离纯化

5.1.3 偶联多角度静态光散射的体积排阻凝胶层析实验

5.1.4 cTHL晶体生长条件的筛选与优化

5.1.5 晶体衍射与数据收集

第二节 实验结果

5.2.1 重组表达质粒的构建与重组蛋白序列分析

5.2.2 cTHL的分离纯化

5.2.3 cTHL聚合状态的确定

5.2.4 cTHL晶体生长条件的优化

5.2.5 晶体衍射与数据处理

5.2.6 结构解析

第三节 分析与讨论

5.3.1 cTHL晶体结构描述

5.3.2 cTHL底物结合位点

5.3.3 cTHL四聚体的聚合状态与其功能的关系

第四节 本章小结与展望

第六章 结论

参考文献

附录1 英文缩写

附录2 个人简历

附录3 在学期间发表的学术论文情况

致谢