产脂肪酶微生物的筛选及其全细胞固定化研究

摘要

在石油资源日趋枯竭和需求量日益扩大的双重压力下，大力发展生物柴油对推动经济可持续发展、减轻环境压力、控制温室气体排放和建设低碳社会具有特别重要的战略意义。生物酶法合成生物柴油与其他方法相比，具有反应条件温和、醇用量小、对原料中水和游离脂肪酸含量要求低、无污染排放等优点。但目前商业脂肪酶一般价格较高，制约其在工业生产中的广泛应用。
　　 土壤中蕴含丰富的微生物资源，而脂肪酶在微生物中分布广泛，因此本研究首先从富油土壤中自主筛选具有产脂肪酶活性的菌株，研究其酶学活性和生物学特性，寻求适于植物油脂酯化合成生物柴油的菌株，以期降低酶法制生物柴油的工业生产成本。利用维多利亚蓝法筛选得到一种产脂肪酶活性较好的菌株。经16S rRNA分子生物学鉴定，该菌株为阴沟杆菌(Enterobacter sp.)。本论文对该菌株产脂肪酶活性进行了研究。通过研究时间、温度等条件对阴沟杆菌产脂肪酶活性的影响，确定生产脂肪酶的最佳周期为4天，最佳培养温度为32℃。随着培养液pH从弱酸性向弱碱性，再向强碱性变化，脂肪酶活性先上升后下降，确定最佳pH为8.5。
　　 游离酶易聚集成团，极不稳定，且不易分离，流失严重，使得酶法制生物柴油成本过高，所以酶的固定化技术得到一定发展。目前酶的固定化技术由于固化效率低和酶失活较严重，成本较高等原因，制约着该技术的产业化应用。本论文分别尝试和比较了几种脂肪酶固定法。吸附固定法：利用滤纸结合真空抽滤将发酵液中的脂肪酶固定到滤纸上，脂肪酶活性失活率约为50％；合成了一种多胺化壳聚糖金属配合物小球作为吸附载体，用来吸附产脂肪酶菌株全细胞，结果未检出活性；全细胞包埋法：将海藻酸钠与发酵液共同培养，之后在氯化钙溶液中钙化成球，得到包埋有产脂肪酶菌株的海藻酸钙凝胶颗粒，然后用壳聚糖溶液对海藻酸钙颗粒进行包埋，获得了一种包埋胶囊，海藻酸钙凝胶颗粒能够保持相应脂肪酶活性的32％左右，包埋胶囊未检出活性，但是剖开胶囊能够检测出少量活性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

第一节 研究的目的和意义

1.1.1 研究目的

1.1.2 研究意义

第二节 选题的背景

1.2.1 能源形势严峻

1.2.2 生物柴油兴起

第三节 文献综述

1.3.1 生物柴油概况

1.3.2 脂肪酶概述

1.3.3 产脂肪酶菌株全细胞固定

第四节 研究内容与方法

1.4.1 菌种筛选

1.4.2 菌种鉴定

1.4.3 多孔多胺化壳聚糖金属配合物小球载体的合成

1.4.4 多孔多胺化壳聚糖小球固定产脂肪酶菌株全细胞

1.4.5 壳聚糖胶囊包埋产脂肪酶菌株全细胞

第五节 课题的特色与创新之处

1.5.1 自主筛选菌株

1.5.2 全细胞催化剂制备

1.5.3 固定化载体新颖

第六节 论文结构安排

第二章 试验材料与方法

第一节 试验材料

2.1.1 原料与试剂

2.1.2 仪器与设备

第二节 产脂肪酶菌株分离、筛选与鉴定

2.2.1 培养基与试剂的制备

2.2.2 菌株的筛选与分离

2.2.3 菌株的形态学分析

2.2.4 菌株的分子生物学鉴定

第三节 脂肪酶活性的测定

2.3.1 脂肪酶活性的定义

2.3.2 氢氧化钠滴定法测脂肪酶活性

2.3.3 分光光度法测脂肪酶活性

第四节 脂肪酶的固定化

2.4.1 吸附法固定化全细胞脂肪酶

2.4.2 包埋法固定化全细胞

2.4.3 活性测试

第五节 用脂肪酶催化大豆油生产生物柴油

2.5.1 反应体系的建立

2.5.2 试验步骤

第三章 试验结果与讨论

第一节 产脂肪酶菌株的筛选、分离与鉴定

3.1.1 培养基成分对筛选的影响

3.1.2 筛选菌株的形态学分析

3.1.3 菌株的分子生物学鉴定

第二节 优化培养条件的确定

3.2.1 培养时间

3.2.2 培养温度

3.2.3 pH值

第三节 脂肪酶的固定化

3.3.1 吸附法固定

3.3.2 包埋法固定

3.3.3 固定化试验的活性测试

第四节 用脂肪酶催化大豆油生产生物柴油

3.4.1 脂肪酶用量对转酯化反应的影响

3.4.2 阴沟杆菌脂肪酶催化转酯化反应

第四章 结论与展望

第一节 主要结论

4.1.1 自主筛选到较高产脂肪酶活性菌株

4.1.2 滤纸固定化脂肪酶能够保持游离脂肪酶活的50％

4.1.3 多胺化壳聚糖金属配合物小球吸附固定脂肪酶活性

4.1.4 壳聚糖包埋法固定脂肪酶活性

第二节 展望

参考文献

致谢

个人简历