组蛋白乙酰化酶p300抑制剂对t(8;21)AML细胞的生物学行为的作用及机制研究

摘要

背景：急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是常见的血液系统恶性肿瘤，临床上约15％的AML病人伴有t(8；21)(q22；q22)染色体异常，而其编码的异常蛋白AML1-ETO被证实在t(8；21)阳性急性髓系白血病的发生发展中起到了重要的作用。最新研究证实组蛋白乙酰化酶p300在AML1-ETO对下游基因的激活过程中起到了重要的辅助作用，故p300很有可能成为有潜力的抗白血病治疗新靶点。
　　 目的：研究组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646对t(8；21)阳性急性髓系白血病细胞生物学行为的作用及机制。
　　 方法：第一部分，应用Cell Count Kit-8及克隆集落形成实验等方法，检测组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646在体外对t(8；21)AML细胞系的增殖和克隆形成能力的作用；应用流式细胞技术，检测C646对AML细胞系凋亡和周期的作用。第二部分，应用荧光定量PCR以及Western Blot技术，在mRNA以及蛋白水平检测C646处理后t(8；21)AML细胞系内BCL-2及组蛋白H3乙酰化水平的变化。第三部分，建立△AE转基因白血病小鼠模型，采集小鼠脾脏白血病细胞，采用C646处理，观察细胞体外克隆形成能力，并经尾静脉回输至C57/BL6J小鼠体内，观察小鼠生存期。
　　 结果：第一部分，在t(8；21)阳性的Kasumi-1以及SKNO-1细胞系中，C646处理24h后细胞增殖及克隆集落形成能力即受到明显的抑制，且这种抑制作用可持续72h或以上(P<0.01)，并随C646浓度的增高而显著提高(P<0.01)，但延长C646处理时间并不能提高相应的作用(P>0.05)；C646处理可对Kasumi-1、SKNO-1和稳定表达AML1-ETO的U937-AE白血病细胞系的凋亡产生诱导作用，但对AML1-ETO阴性的U937细胞系无显著诱导凋亡作用；C646在较低浓度下即可对AMLl-ETO阳性的AML细胞系产生明显的细胞周期阻滞的作用。
　　 第二部分，采用10μM的C646处理Kasumi-1、SKNO-1细胞系24h，即可在mRNA水平显著的抑制BCL-2基因的表达(P<0.05)，但提高C646浓度以及延长处理时间没有明显提高其对BCL-2 mRNA表达的抑制作用；Western Blot检测提示在该浓度下C646还可明显抑制BCL-2的蛋白表达，同时降低组蛋白H3的乙酰化水平。第三部分，采用C646和DMSO分别在体外处理△AE转基因小鼠脾脏白血病细胞，经C646处理的白血病细胞的克隆形成能力与DMSO处理的对照组细胞相比明显减弱，将两组细胞分别经尾静脉回输至小鼠体内，接受C646处理后白血病细胞的小鼠生存期较DMSO对照组明显延长(P<0.01)。
　　 结论：1.组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646可以在体外抑制AML1-ETO阳性的AML细胞系的增殖和克隆形成能力；2.C646对t(8；21)AML细胞生物学功能的影响强度在一定范围内与剂量呈强依赖性，但延长处理时间并不能增强该效应；3.C646对AML1-ETO阳性白血病细胞的诱导凋亡和增加细胞周期阻滞的作用是导致细胞增殖和克隆形成能力受到抑制的原因之一；4.C646可通过降低组蛋白乙酰化水平，抑制AML1-ETO下游基因Bc1-2的激活作用，导致BCL-2基因的mRNA以及蛋白表达水平下降，从而发挥对AML1-ETO阳性细胞系细胞生物学功能的影响；5.C646体外处理可以抑制△AE转基因白血病小鼠模型原代白血病细胞的体外克隆形成能力；并延长小鼠生存期。上述研究结果提示组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646是一种具有临床应用前景的t(8；21)AML表观遗传调控药物。

目录

文摘

英文文摘

中英文对照

第一章 引言

第一节 伴t(8；21)(q22；q22)易位的急性髓系白血病研究进展

1.1.1 伴t(8；21)易位的急性髓系白血病研究进展

1.1.2 AML1-ETO融合基因及其编码蛋白概述

第二节 t(8；21)急性髓系白血病表观遗传学改变

1.2.1 AML1-ETO与甲基化

1.2.2 AML1-ETO对组蛋白去乙酰化酶的影响

1.2.3 AML1-ETO与组蛋白乙酰化酶的作用

第三节 组蛋白乙酰化酶p300抑制剂研究进展

第四节 选题依据及研究设计

1.4.1 选题依据

1.4.2 拟解决科学问题

第二章 实验设计

第一节 组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646对t(8；21)急性髓系白血病细胞生物学行为的作用

第二节 组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646对t(8；21)急性髓系白血病细胞生物学行为作用影响的分子机制

第三节 组蛋白乙酰化酶p300抑制剂C646对△AE转基因小鼠白血病模型的作用

第三章 C646对t(8；21)急性髓系白血病细胞生物学行为的作用

第一节 实验材料和方法

3.1.1 所需仪器及试剂

3.1.2 实验方法

第二节 实验结果

3.2.1 p300抑制剂C646可以抑制t(8；21)阳性的白血病细胞系的增殖

3.2.2 p300抑制剂C646可抑制t(8；21)阳性白血病细胞系的克隆形成

3.2.3 p300抑制剂C646可诱导t(8；21)白血病细胞凋亡

3.2.4 p300抑制剂C646可以诱导t(8；21)阳性细胞的细胞周期阻滞

第三节 讨论

第四节 小结

第四章 C646对t(8；21)急性髓系白血病细胞生物学行为影响的分子机制

第一节 实验材料和方法

4.1.1 所需试剂及仪器

4.1.2 实验方法

第二节 实验结果

4.2.1 p300抑制剂C646处理后t(8；21)AML细胞系中mRNA水平变化

4.2.2 p300抑制剂C646处理后t(8；21)AML细胞系中蛋白水平的变化

第三节 讨论

第四节 小结

第五章 C646对△AE转基因小鼠白血病模型的作用

第一节 实验材料和方法

5.1.1 所需材料及试剂

5.1.2 实验方法

第二节 实验结果

5.2.1 C646体外处理对小鼠△AE细胞系克隆形成能力的影响

5.2.2 C646体外处理小鼠△AE细胞系对小鼠成白血病能力的影响

第三节 讨论

第四节 小结

第六章 结论

参考文献

致谢

个人简历