食品中酸性橙Ⅱ、日落黄酶联免疫吸附测定法的研究

摘要

合成色素是通过化学合成的方法合成的，相对于天然色素而言，目前在全世界应用最为普遍。常见的合成色素大多都是偶氮类，例如酸性橙Ⅱ(OrangeⅡ)、苏丹红Ⅰ-Ⅳ(SudanⅠ-Ⅳ)、日落黄(Sunset Yellow)、酸性红(Carmosine)等等。相比于天然色素，合成色素在价格、颜色、稳定性和成本上都有巨大的优势，但合成色素的安全问题，尤其是潜在的致癌和致畸性，受到越来越多的各国科学研究者重视。我国食用合成色素的用量逐年增加，一系列恶性食品安全事件频频发生，直接威胁到广大消费者的生命及身体健康。我国的食品产品中，非法添加或者违规添加合成色素的现象愈演愈烈，而现有的标准检测方法一液相色谱检测法在检测过程中耗时长，检验步骤复杂，因此，开发更加简便、即时、准确性的检测方法就非常急迫和意义重大。
　　 各国研究学者已开发出许多检测方法，针对合成色素的检测。目前在合成色素检测的文献研究报道中，主要有色谱法、电化学法、分光光度法等。而这三种方法都有普遍的问题：仪器价格昂贵，操作繁琐，分析前处理非常复杂，样品的处理净化过程很繁琐。而免疫分析方法相对来说更加经济、样本前处理过程简单，大大提高了检测速度，该法利用抗原.抗体间的高特异性结合，专属性强，检测限可达ng至pg的级别，因而应用前景非常广泛。
　　 本研究拟建立两种常见偶氮类合成色素-酸性橙Ⅱ及日落黄的快速酶联免疫吸附检测法(ELISA)。我们对酸性橙Ⅱ小分子半抗原成功的进行了结构改造，避免了互变异构带来的障碍，针对其磺酸基团设计实施了一系列化学反应，并且成功的与偶联剂和载体蛋白相结合，成功制备出酸性橙Ⅱ免疫原和包被抗原(两种合成方案，每种方案3只兔子)，免疫健康雄性新西兰大白兔，心脏采血后，所获得的抗体效价>1/160000，用酸性橙Ⅱ作竞争抑制率曲线，检测限为0.11ngmL-1，半数抑制浓度(IC50)为0.61 ng mL-1。该多克隆抗体特异性良好，与酸性红B交叉反应率<0.01％，与栀子黄交叉反应率<0.001％，与胭脂红交叉反应率<0.0001％，与日落黄交叉反应率<0.0001％。选取辣椒面、辣椒油、卤肉作为食品检测体系，添加回收率在84.0％-131.8％之间，变异系数在2.8％-20.0%之间，表明该方法在食品样品检测时重复性、精确度、准确度较好。
　　 鉴于日落黄带有两个磺酸基团以及互变异构的复杂性，采取重氮化反应重新合成日落黄的结构改造物，引入末端羧基作为活性基团。与偶联剂和载体蛋白相结合，制备出日落黄免疫原和包被抗原(两种合成方案，每种方案2只兔子)，免疫健康雄性新西兰大白兔，心脏采血后，得到的抗体效价>1/160000，用日落黄作竞争抑制率曲线，检测限为0.10 ng/mL，IC50为0.52 ng/mL。该多克隆抗体特异性良好，与胭脂红交叉反应率<0.1％，与苋菜红交叉反应率<0.01％，与酸性红B交叉反应率<0.01％，与柠檬黄交叉反应率<0.001％，与喹啉黄交叉反应率<0.001％，与栀子黄交叉反应率<0.001％。
　　 本实验利用化学修饰得到偶氮类合成色素酸性橙Ⅱ和日落黄的人工免疫原，所得抗体效价理想，特异性较强。依此建立了的ELISA检测方法，灵敏度高，满足检测标准的要求，与其它结构类似物交叉反应率小，检测时不易受干扰，食品样品的添加回收率和重复性结果较好。本研究所建立的ELISA法能够快速、准确、灵敏筛选食品产品中酸性橙Ⅱ和日落黄，对于控制抽检成本、提高检测效率、确保检测准确性、保证食品市场合规具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

第一节 合成色素概述

第二节 合成色素的检测方法

1.2.1 色谱法

1.2.2 电化学法

1.2.3 分光光度法

1.2.4 免疫分析法

第三节 本论文设计目的和思路

第二章 实验部分

第一节 实验材料与设备

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.1.3 缓冲液

第二节 合成色素免疫原和包被抗原的制备

2.2.1 OrangeⅡ免疫原和包被抗原的制备

2.2.2 Sunset Yellow免疫原和包被抗原的制备

第三节 OrangeⅡ和Sunset Yellow多克隆抗体的制备

2.3.1 免疫方案

2.3.2 心脏采血

2.3.3 抗体的保存

第四节 抗体检测

2.4.1 OrangeⅡ多克隆抗体的检测

2.4.2 Sunset Yellow多克隆抗体的检测

第三章 结果与讨论

第一节 免疫原的合成与鉴定

3.1.1 OramgeⅡ免疫原的合成与鉴定

3.1.2 Sunset Yellow免疫原的合成与鉴定

第二节 抗体的制备过程

3.2.1 免疫方案

3.2.2 抗血清的制备与冻存

第三节 抗体的检测

3-3.1 影响ELISA检测的因素

3.3.2 OrangeⅡ抗体的检测结果与分析

3.3.3 Sunset Yellow抗体的检测结果与分析

第四章结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果