小鼠Mageb18基因克隆、表达分析及其调节黑色素瘤B16-F0细胞恶性表型的初步研究

摘要

黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigens，MAGE)是一个多成员基因家族。目前在人、大鼠和小鼠中已经发现的MAGE基因约100个左右。所有的MAGE基因其蛋白序列中都有一个含200个氨基酸左右的结构域，称为MAGE同源结构域(MHD)。根据MAGE基因序列保守性的不同，这些基因可以分为多个不同的亚家族。另外，根据表达谱的不同，MAGE基因还可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两类。Ⅰ型MAGE基因由MAGE-A、-B和-C三个亚家族组成，其他的亚家族则都属于Ⅱ型MAGE基因。已经发现，Ⅰ型MAGE基因在许多不同类型的肿瘤组织和细胞中表达，但是在正常组织中只有睾丸、卵巢和胎盘表达。正好相反，Ⅱ型MAGE基因却在许多正常组织中广谱表达。因为睾丸、卵巢和胎盘中HLA分子的表达水平很低，因此Ⅰ型MAGE基因独特的表达特点使得它们成为肿瘤免疫治疗的理想靶标。目前，针对Ⅰ型MAGE基因已经开发了许多不同类型的肿瘤疫苗，有的甚至已经开始进入临床试验。但是，由于对Ⅰ型MAGE基因的表达谱及功能的研究相对较少，因此这在很大程度上限制了MAGE肿瘤疫苗的推广和应用。
　　 虽然有研究表明，Ⅰ型MAGE基因在正常组织中的表达是睾丸特异的，但是我们前期利用表达序列标签(expressed sequence tag，EST)序列都对应于小鼠Mageb18基因。据此，我们假设认为，小鼠Mageb18基因在正常组织中的表达不是睾丸特异的，而是广谱的。本课题的目的就是克隆小鼠的Magebl8基因，分析它的表达特征以及调控机制，并研究它在调节肿瘤细胞恶性表型方面的功能以及相关分子机制。
　　 为此，我们首先借助生物信息学工具分析和预测了Mageb18基因的结构和功能。结果表明，小鼠Mageb18基因全长2160bp，由5个外显子组成。它最大的开放阅读框为984bp，编码蛋白含327个氨基酸，蛋白的理论分子量和等电点分别为37203.31 Da和6.43。MAGEB18蛋白含有一个MAGE N-末端结构域和一个保守的MHD，分别位于Arg3-Asp82和he91-Ala289。亚细胞定位预测表明，MAGEB18蛋白不含亚细胞定位序列，但是可能存在8个磷酸化位点和一个N-豆蔻酰化位点，提示MAGEB18可能是一个胞浆蛋白，并且存在翻译后修饰加工。以前的研究表明，Ⅰ型MAGE基因主要定位在X染色体，而且同一亚族的基因往往形成相对独立的基因簇。染色体定位分析发现，小鼠Mageb18基因也定位在X染色体的C2-C3区域，并与其他多个MAGE-B亚家族的基因形成基因簇。而且系统进化树分析也表明，Mageb18基因与MAGE-B亚家族基因间的亲缘关系最近。此外，基因同源搜索则发现，Mageb18基因在高等哺乳动物中高度保守，而在哺乳动物以外的物种中不存在。这些结果集中提示，Mageb18基因是一个在高级哺乳动物中高度保守的Ⅰ型MAGE基因。
　　 接下来，RT-PC分析Mageb18基因的表达谱发现，小鼠Mageb18基因在正常组织中的表达确实是非睾丸特异的。除了睾丸以外，它在胃、大肠、小肠、脾脏、淋巴结、骨髓和外周淋巴细胞都有较高水平表达。另外，我们发现Mageb18基因在小鼠睾丸中的表达是发育相关的。它在出生后第1天的睾丸中开始表达，而且随着时间的进行它的表达逐渐增高，在第21天左右达到最高，此后一直维持在较高的表达水平，提示Mageb18可能与睾丸的发育和精子的形成有关。继续分析Mageb18基因在小鼠细胞株中的表达谱发现，Mageb18在成纤维瘤细胞L929、黑色素瘤细胞B16-F0、肝癌细胞MM45T.Li、乳腺癌细胞4T1、胚胎成纤维细胞NIH3T3和巨噬细胞RAW264.7中表达，而在肝癌细胞H22和脑胶质瘤细胞C6中不表达。但是DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A能够激活Mageb18阴性细胞H22和C6中Mageb18基因的表达，提示表观遗传机制调节Mageb18的转录激活。
　　 然后，利用Western印迹分析HEK293中瞬时表达的HA-MAGEB18融合蛋白表明，小鼠Mageb18基因编码的蛋白大小约为46 kDa。进一步分析小鼠正常组织中内源性MAGEB18蛋白则发现，MAGEB18蛋白在小鼠的胃、大肠、小肠、脾脏、淋巴结、骨髓和血液淋巴细胞中表达，而在脑、心脏、肺、肝脏和肾脏中不表达，提示在正常组织中MAGEB18蛋白的表达谱与其mRNA的表达谱完全一致。另外，在组织中全长MAGEB18蛋白大小也为46 kDa左右，但是它可能存在翻译后的剪切加工，从而产生一条大小约为26 kDa的片段。奇怪的是，小鼠细胞株中的内源性MAGEB18蛋白只存在大小为46 kDa一种形式。这些结果提示，MAGEB18蛋白在小鼠组织和细胞株中可能存在不同的翻译后修饰，从而导致形成大小不同的蛋白产物。利用间接免疫荧光分析.MAGEB18蛋白的亚细胞定位表明，小鼠MAGEB18蛋白主要定位在细胞浆中，但在不同细胞株的细胞核里也有或多或少的定位。免疫组化分析进一步发现，在睾丸组织中MAGEB18蛋白主要在具有增殖能力的初级和次级精原细胞的细胞浆中表达，但是在成熟的精子中不表达。这些结果提示，MAGEB18蛋白是一个胞浆蛋白，它可能与细胞的增殖表型有关。
　　 接下来，为了阐明Mageb18基因的功能，我们通过siRNA技术干扰内源性MAGEB18基因的表达，定量RT-PCR和Western印迹分析表明siRNA能够有效抑制细胞中Mageb18基因在mRNA和蛋白水平的表达。随后我们通过生长曲线分析、平板克隆形成实验以及皮下成瘤实验证明，干扰Mageb18基因的表达能够显著抑制B16-F0细胞和4T1细胞体外和体内的增殖。Annexin-V-APC/7-AAD细胞凋亡分析发现，干扰Mageb18能够显著增强B16-F0细胞的凋亡。Western印迹分析则表明，这个细胞凋亡增强的过程可能与TP53通路有关，因为干扰MAGEB18蛋白的表达能够提高TP53的蛋白水平，同时激活TP53的靶基因p21和Bax。
　　 最后，进一步分析Mageb18基因在小鼠细胞株中的表达发现，MAGEB18蛋白在高成瘤和高转移的肿瘤细胞株，包括肿瘤干细胞和前癌干细胞中表达，提示Mage18基因不仅与细胞增殖表型有关，而且可能还调节细胞的转移特性。为此，我们通过划痕实验、基质胶侵袭实验以及体内肺转移动物模型分析了Mageb18基因对B16-F0细胞运动性的影响。结果表明，干扰MAGEB18蛋白的表达能够显著抑制B16-F0细胞的迁移、侵袭和转移能力。基质金属蛋白酶家族在肿瘤的迁移和转移中扮演重要角色。我们通过RT-PCR分析发现，B16-F0细胞表达多种不同类型的MMPs。但是，干扰Mageb18基因以后只能特异性地下调MMP2和MMP9的表达，而其他MMP的表达却没有明显的差异。这些结果提示，Mageb18基因确实可以通过MMP2和MMP9调节B16-F0细胞的迁移、侵袭和转移。
　　 总之，我们的工作首次证明小鼠Mageb18基因一个非睾丸特异表达的Ⅰ型MAGE基因。我们的结果提示，某些Ⅰ型MAGE基因，至少是Mageb18基因的表达并不像传统观点所认为的那样是睾丸特异的，而是广谱的。由于MAGE家族基因是目前肿瘤疫苗研发中使用最多的靶标，因此我们的结果表明，以MAGE基因为靶标开发肿瘤疫苗之前，为了提高疫苗的有效性和安全性，非常有必要对该MAGE基因在正常组织中的表达谱和功能进行深入的研究。