利用敲减研究ATF4在乳腺癌细胞生长中的作用

摘要

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤。患有乳腺癌的病人大多由于癌症转移到其它组织而非原发的肿瘤导致了死亡。乳腺癌有很高的可能性会转移到骨中。激活转录因子4(ATF4)是环化一磷酸腺苷应答原件结合(CREB)蛋白家族的一员，在羧基端有一个碱性亮氨酸拉链(bZip)结构并在内质网(ER)压力的作用下通过PERK-eIF2α-ATF4途径被调节。同时ATF4是骨发育中重要的调节因子。为了研究ATF4在乳腺癌发生中起到的作用，我建立了敲减ATF4蛋白的MDA-MB231细胞株。在体外培养时，敲减ATF4对于MDA-MB231细胞的增殖没有影响。为了研究体内水平上ATF4在乳腺癌发生中的作用，我将敲减了ATF4的MDA-MB231细胞注射到裸鼠的皮下。与体外实验不同的是，敲减了ATF4的MDA-MB231细胞形成的肿瘤生长上有严重的抑制。这可能是由于体内肿瘤环境的压力造成的，而这种压力在体外培养中并不存在。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 乳腺癌简介、微环境和转移

1．1．1 乳腺癌简介

1．1．2 肿瘤微环境

1．1．3 乳腺癌的转移

第二节 ATF4的调控机制，功能

1．2．1 ATF4的简介

1．2．2 ATF4蛋白水平受到多方面的调节

1．2．3 一些由ATF4激活转录的蛋白

1．2．4 ATF4在肿瘤反生和骨发育中的一些作用

第三节 本文研究的对象和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 所用感受态大肠杆菌，细胞和实验动物

2．1．2 细胞培养所用培养基和试剂

2．1．3 LB培养基配置

2．1．4 Western杂交所用试剂

2．1．5 其它实验所用试剂和试剂盒

2．1．6 文章中所涉及的引物

2．1．7 质粒

2．1．8 敲减ATF4的慢病毒

2．1．9 主要的检测仪器

第二节 实验方法

2．2．1 MDA-MB231细胞总蛋白的提取

2．2．2 Western杂交

2．2．3 MDA-MB231细胞中RNA的提取

2．2．4 RNA的反转录PCR

2．2．5 目的基因的Real-time PCR

2．2．6 MDA-MB231细胞核蛋白的提取(使用Thermo NE-PER试剂盒)

2．2．7 MDA-MB231细胞的培养

2．2．8 MDA-MB231细胞的转染

2．2．9 MDA-MB231细胞中ATF4蛋白转录活性的荧光素酶分析试验

2．2．10 大肠杆菌中质粒的提取(少量，全式金小提试剂盒)

2．2．11 大肠杆菌中质粒的提取(大量，Plasmid Midi kit)

2．2．12 大肠杆菌的转化

2．2．13 细胞的慢病毒感染

2．2．14 利用Puromycin筛选稳定表达细胞系所用浓度的确定

2．2．15 利用Puromycin筛选稳定表达细胞系

2．2．16 利用流式细胞仪筛选稳定表达细胞系

2．2．17 稳定表达细胞系单克隆化的建立

2．2．18 利用CCK-8试剂盒测定MDA-MB细胞的增殖

2．2．19 MDA-MB231细胞的裸鼠皮下注射和成瘤的测量

2．2．20 核酸的琼脂糖凝胶电泳

2．2．21 BCA法测定蛋白浓度(Novagen BCA试剂盒)

第三章 ATF4稳定敲减的MDA-MB231细胞系的建立

第一节 利用RNAi的方法敲减MDA-MB231细胞系中的ATF4蛋白

3．1．1 ATF4的RNAi慢病毒的构建

3．1．2 利用慢病毒侵染MDA-MB231细胞系

第二节 ATF4敲减的MDA-MB231细胞系的筛选

3．2．1 ATF4敲减的MDA-MB231细胞系的初步筛选和鉴定

3．2．2 ATF4敲减的MDA-MB231细胞系的进一步筛选和鉴定

第三节 ATF4敲减的MDA-MB231细胞系的单克隆化

3．3．1 ATF4敲减的MDA-MB231细胞系的单克隆化

3．3．2 单克隆化的ATF4敲减的MDA-MB231细胞株的蛋白水平的鉴定

3．3．3 单克隆化的ATF4敲减的MDA-MB231细胞株的转录激活活性的鉴定

第四节 小节

第四章 ATF4在体外和体内水平影响乳腺癌细胞的生长

第一节 ATF4在体外水平影响乳腺癌细胞的生长

4．1．1 CCK-8试剂盒的工作原理

4．1．2 利用CCK-8试剂盒测量ATF4稳定敲减的MDA-MB231细胞株的生长速率

第二节 ATF4稳定敲减的MDA-MB231细胞的成瘤实验

4．2．1 小鼠皮下成瘤实验简介

4．2．2 ATF4的敲减阻碍MDA-MB231细胞的成瘤

第三节 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果