牛泡沫病毒非结构蛋白Bet及BTas对病毒复制影响的研究

摘要

泡沫病毒(foamy viruses，FV)，在分类上属于反转录病毒科泡沫病毒亚科泡沫病毒属，为一类特殊的复杂反转录病毒。其基因组为二聚线状单链RNA，基因组的结构组成与顺序同典型的反转录病毒相似。前病毒两端具有长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)，中间为结构基因gag、pol、env。与典型反转录病毒不同的是泡沫病毒在env与3'LTR之间存在内部启动子(internal promoter,IP)，负责启动下游非结构基因tas，bet等的转录。
　　 牛泡沫病毒(bovine foamy virus，BFV)是该属病毒的一员，在非灵长类泡沫病毒中研究的相对清楚。本室一直致力于对自主分离出的毒株BFV3026进行研究，证实BTas(BFV trans-activator of spumavirus)为BFV的反式激活因子，并对其展开功能研究。同时确证了BFV中存在Bet蛋白，证明其可抑制BTas对LTR和IP启动子的反式激活。这提示在病毒的调节机制中Bet蛋白可能发挥了一种负调控的作用。本文在前人研究的基础上，进一步对BFV的两种非结构蛋白Bet及BTas在病毒整体水平对其在病毒复制中所发挥的功能进行探索。
　　 本文首先成功构建了Bet缺失的BFV3026感染性克隆pBS-BFV-△Bet，用其转染293T细胞后与BFVL指示细胞系共培养发现该感染性克隆与野生型相比对LTR激活能力增强，进一步通过免疫印迹实验发现Bet缺失的BFV3026感染性克隆与野生型相比BTas蛋白及Gag蛋白的表达量均有增加。说明缺失Bet使得病毒滴度上升，证明在病毒水平Bet作为负调控因子影响了病毒的复制。随后本文构建了Bet稳定表达细胞系Cf2Th-Bet，进一步对Bet蛋白的功能展开研究，本文发现在Cf2Th-Bet细胞中，BFV3026病毒及该病毒感染性克隆的复制均受到了一定程度的抑制，该结果进一步验证了Bet具有负调控的作用。
　　 本文同时构建了缺失BTas的感染性克隆pBS-BFV-△BTas及BTas乙酰化位点突变的感染性克隆，发现BTas缺失的感染性克隆丧失了活性，同时BTas关键性乙酰化位点的突变也显著影响感染性克隆的感染性。该结果首次在病毒水平确证了BTas反式激活的作用及乙酰化修饰对其行使该功能的重要性。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 泡沫病毒概述

1．1．1 泡沫病毒的生物学特点

1．1．2 泡沫病毒基因组

1．1．3 泡沫病毒生活周期

第二节 泡沫病毒的基因表达调控

1．2．1 泡沫病毒的启动子

1．2．2 反式激活因子Tas蛋白概述

1．2．3 泡沫病毒Bet蛋白概述

第三节 RNA病毒的感染性克隆技术以及应用

1．3．1 RNA病毒的感染性克隆简介

1．3．2 RNA病毒的感染性克隆技术的应用

第四节 本研究前期基础

1．4．1 BFV3026感染性克隆

1．4．2 BFV Bet的相关工作

第五节 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 细胞

2．1．2 病毒

2．1．3 菌株

2．1．4 质粒

2．1．5 主要试剂及溶液配方

第二节 实验方法

2．2．1 基因操作

2．2．2 细胞相关实验

2．2．3 免疫印迹

2．2．4 稳定表达细胞系的筛选

第三章 结果

第一节 Bet蛋白在BFV复制中的作用

3．1．1 Bet缺失感染性克隆的构建及鉴定

3．1．2 Bet在病毒水平对BFV复制的作用

第二节 BTas蛋白在BFV复制中的作用

3．2．1 BTas缺失感染性克隆的构建及鉴定

3．2．2 BTas在病毒水平对BFV复制的作用

3．2．3 BTas乙酰化位点突变感染性克隆的构建和鉴定

3．2．4 BTas乙酰化修饰在病毒水平对BFV复制的作用

第四章 讨论

第一节 感染性克隆的作用

第二节 稳定表达Bet细胞系的作用

第三节 实验中存在的问题

第五章 结论

参考文献

致谢

附录 PFV感染性克隆

个人简历

在学期间发表的论文与研究成果