牛泡沫病毒Bet蛋白对病毒复制抑制机制的研究

摘要

泡沫病毒(Fomay virus，FV)属在分类上归于反转录病毒科泡沫病毒亚科，它们能在多种动物中产生持续性感染。但至今没有其引发疾病的报道。该属病毒具有复杂的基因组结构和独特的基因表达调节过程，与传统的反转录病毒区别较大。它的基因转录受到两个启动子的调节，其中位于5’端的LTR(longterminal repest)负责结构基因的转录，位于env基因内部的启动子IP(internalpromoter)则调节反式激活因子(transactivator of spmavirus，Tas)等非结构蛋白的合成。Tas蛋白作为病毒的反式激活因子，可以通过直接结合在这两个启动子上激活下游基因表达。Bet则是存在于病毒复制过程中，受IP调节的另一个非结构蛋白。本室主要研究牛的泡沫病毒(bovine fomay virus，BFV)，本文即是对BFV Bet蛋白在病毒复制过程中的功能及其作用机制进行深入的研究。
　　 在本文中，发现Bet蛋白可以抑制BFV的复制，并对其作用的主要机制进行了研究探讨。主要获得了以下几个层面的结果：
　　 1)报告系统层次，利用荧光素酶报告系统，证明了Bet可以抑制BTas对病毒LTR和IP两个启动子的激活，并且证明这种抑制呈剂量依赖性。
　　 2)分子机制层次，本文对Bet抑制BTas反式激活LTR的机制进行了研究，通过GST-pull down和CO—IP实验证明了BTas和Bet有直接的相互作用，并且利用凝胶迁移率阻滞实验(electrophoreticmobility shift assay，EMSA)证明了Bet和BTas都同LTR有直接的相互作用，且Bet通过结合在LTR上行使抑制功能。
　　 3)作用精确序列确定，找出了和Bet抑制BTas反式激活的两段DNA序列，并发现这两段DINA序列在抑制作用中起不同的作用。其中LTR(613—635)同时被BTas和Bet结合，Bet通过和BTas竞争而起到抑制作用，LTR(635—654)只被Bet结合，它通过空间位阻的方式影响BTas在LTR(613—635)和LTR(654—674)的结合并最终影响了后者对LTR的反式激活作用。
　　 4)细胞水平，虽然本文发现并探索了Bet抑制BTas反式激活LTR的机制，但没能在细胞水平检测出Bet对病毒复制的抑制。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

第一节 泡沫病毒概述

1.1.1 泡沫病毒的生物学特性

1.1.2 泡沫病毒的基因组结构

1.1.3 泡沫病毒的生活周期

1.1.4 泡沫病毒载体的研究

第二节 泡沫病毒的启动子

第三节 Tas蛋白概述

第四节 Bet蛋白概述

第五节 本研究的前期基础

1.5.1 BFV LTR的结构特点和转录调节

1.5.2 BFV IP的结构与功能

1.5.3 BFV Bet的相关工作

第六节 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 细胞

2.1.2 病毒

2.1.3 菌株

2.1.4 质粒

2.1.5 主要试剂及溶液配方

第二节 实验方法

2.2.1 细胞的培养

2.2.2 引物设计及DNA片段合成

2.2.3 质粒构建

2.2.4 报告基因的瞬时表达分析

2.2.5 重组蛋白的表达纯化

2.2.6 凝胶阻滞实验(EMSA)

2.2.7 抗体制备

2.2.8 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)

2.2.9 GST-pull down

第三章 结果

第一节 Bet抑制BTas对BFV启动子的激活

3.1.1 Bet对自身启动子活性的影响

3.1.2 Bet对BTas反式激活功能的影响

第二节 Bet抑制BTas激活LTR的机制探讨

3.2.1 Bet亚细胞定位

3.2.2 证实LTR中响应BTas激活的核心区域为TREH

3.2.3 Bet可直接结合LTR

3.2.4 Bet对LTR结合区域的确定

3.2.5 Bet通过空间位阻抑制BTas激活LTR

3.2.6 Bet和BTas竞争结合LTR613-635段抑制其激活作用

第三节 Bet和BTas有直接的相互作用

3.3.1 GST-pull dwon实验

3.3.2 Co-IP实验

第四节 Bet对BFV复制的影响

3.4.1 Western Blot检测Bet对BFV的影响

3.4.2 BFVL检测Bet表达对BFV的影响

第四章 讨论

第一节 牛泡沫病毒Bet蛋白在LTR上的结合序列

第二节 Bet与病毒复制的关系

第三节 实验中存在的问题

第四节 BFV复制的时序模型

第五章 结论

参考文献

致 谢

个人简历与在学期间发表的论文与研究成果