ID4对沉默SOX2之后的肿瘤复发的影响

摘要

目前，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。越来越多的研究表明，转录因子SOX2在肿瘤的发生与发展过程中起着十分重要的作用。前期的研究结果表明，沉默SOX2基因的表达虽然能够有效抑制荷瘤小鼠中肺癌的发生与发展，但是仍然有一部分小鼠出现肿瘤复发的现象。本研究拟探讨SOX2负向调控的原癌基因，并明确其在沉默SOX2后肿瘤复发中的作用。
　　 在利用RNA-seq技术对沉默SOX2之后的基因表达谱的改变进行分析后，挑选了12个候选靶基因，并对它们的表达水平进行了mRNA水平上的确认。通过对基因功能的分析，从中挑选出转录因子ID4作为进一步研究对象。在构建了沉默SOX2之后继而诱导沉默ID4表达的MCF7细胞系后，进一步检测了同时沉默SOX2和ID4对该细胞系转移、增殖、凋亡能力的影响。通过免疫组化方法检测了人乳腺癌组织芯片的196例组织标本，并对其中ID4的表达进行了统计学分析，同时也分析了SOX2与ID4表达的相关性。
　　 首先确认了12个候选靶基因在mRNA水平上都是随着SOX2表达的降低而升高。在迸一步的分析中发现在蛋白水平上，ID4的表达与SOX2也呈现出负相关。构建了沉默SOX2和诱导沉默ID4的稳定细胞系之后发现，在沉默SOX2的基础上，沉默ID4的表达能抑制肿瘤细胞的增殖伴随着增殖标记蛋白Ki67的表达降低。同时也发现稳定细胞系的转移能力也明显降低。通过检测细胞中凋亡蛋白cleaved caspase3的表达，发现其增强了细胞对化疗药物的敏感性，Annexin V/PI的流式分析实验显示了相同的结果。在对人乳腺癌组织芯片进行检测发现ID4的表达在转移组织和淋巴结中表达很高。
　　 以上结果说明ID4作为SOX2负向调控的下游因子，在SOX2沉默后的肿瘤复发过程中起着一定的作用。抑制ID4的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡过程，因此可以作为治疗SOX2之后沉默后肿瘤复发的一个可能靶点。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 转录因子SOX2在肿瘤中的相关作用

1．1．1 Sox家族介绍

1．1．2 SOX2过表达可导致病人存活率的降低

1．1．3 SOX2有助于肿瘤干细胞干性的维持和肿瘤发生

第二节 SOX2参与的复杂信号转导通路

1．2．1 调控SOX2表达的上游分子

1．2．2 调控SOX2表达的下游分子

1．2．3 SOX2与其他蛋白的相互作用

第三节 ID4分子在肿瘤中的作用

1．3．1 Id家族介绍

1．3．2 ID4在神经系统发育和肿瘤中的功能

1．3．3 ID4在乳腺癌中的功能

第二章 实验材料、试剂与仪器

第一节 实验材料

第二节 实验试剂

第三节 主要试剂配方

2．3．1 细胞培养相关试剂

2．3．2 细菌培养相关试剂

2．3．3 琼脂糖电泳相关试剂

2．3．4 SDS-PAGE试剂

2．3．5 Western Blotting相关试剂

2．3．6 免疫组化相关试剂

第四节 实验仪器

第三章 实验方法

第一节 人乳腺癌细胞系MCF-7的培养

3．1．1 细胞复苏

3．1．2 细胞换液

3．1．3 细胞传代

3．1．4 细胞冻存

第二节 细胞总RNA的提取、反转、RT-PCR及Real-time PCR

3．2．1 细胞总RNA的提取

3．2．2 将所提的总RNA反转录成cDNA

3．2．3 RT-PCR

3．2．4 Real-time RT-PCR

第三节 Western blotting

3．3．1 细胞中蛋白提取

3．3．2 Pierce Protein BCA Assay蛋白定量

3．3．3 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制

3．3．4 蛋白样品变性处理

3．3．5 凝胶电泳

3．3．6 蛋白从凝胶转到PVDF膜上

3．3．7 牛奶封闭

3．3．8 目的蛋白一抗孵育

3．3．9 抗目的蛋白的二抗孵育

3．3．10 曝光

第四节 人乳腺癌组织芯片免疫组化染色

3．4．1 烘片

3．4．2 脱蜡

3．4．3 抗原修复

3．4．4 去除内源性过氧化物酶

3．4．5 芯片封闭

3．4．6 目的蛋白抗体孵育芯片

3．4．7 生物素标记的抗目的蛋白一抗的二抗孵育芯片

3．4．8 HRP-生物素偶联的三抗孵育芯片

3．4．9 DAB显色液显色

3．4．10 苏木染色

3．4．11 脱水透明

3．4．12 中性树胶封片

3．4．13 显微镜记录图像

第五节 稳定细胞系的构建

3．5．1 构建沉默ID4的慢病毒shRNA载体

3．5．2 验证所选ID4沉默靶点的沉默效率

3．5．3 制作含有pLV-H1TetO-shID4-Neo的慢病毒

3．5．4 在已有的MCF7细胞系中建立由Dox诱导沉默ID4的稳定细胞系

3．5．5 检测稳定细胞系经Dox诱导的沉默效果

第六节 Transwell实验

第七节 细胞划痕实验

第八节 细胞增殖实验

第九节 细胞凋亡检测

第四章 实验结果

第一节 SOX2低表达后引起基因表达谱的改变

4．1．1 mRNA水平上基因表达的改变

4．1．2 蛋白水平上SOX2沉默引起ID4表达上调

第二节 构建Dox诱导沉默ID4的稳定细胞系

4．2．1 构建的shRNA载体能沉默ID4基因的表达

4．2．2 MCF7细胞系中Dox可以诱导沉默ID4的表达

第三节 沉默SOX2后诱导ID4低表达能抑制肿瘤增殖

第四节 沉默SOX2后诱导沉默ID4能抑制肿瘤细胞迁移

第五节 沉默ID4后能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性

第六节 乳腺癌组织芯片中ID4表达以及ID4与SOX2相关性分析

4．6．1 ID4在人乳腺癌组织和转移淋巴结组织中表达较高

4．6．2 ID4与SOX2表达的相关性分析

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录

附录A Real-time RT-PCR引物

附录B 临床标本

个人简历