毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究

摘要

干细胞(stem cells)维持着生命体组织器官的发生发展以及损伤的修复与再生，随着近年来再生医学的迅猛发展，干细胞治疗在临床中的应用日益广泛，疗效显著，已成为很多难治性疾病的终极治疗手段，干细胞的研究已经成为全国乃至全世界的研究热点。在下文中我们将以毛囊干细胞这一成体干细胞为研究主体，对其生物学特性及其在再生医学中的应用进行研究实验，以期证明毛囊干细胞为再生医学干细胞治疗的理想干细胞源。
　　目的:
　　1.体外分离培养并扩增毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)，建立一种快速高效的细胞培养体系，为后续试验奠定基础;
　　2.通过体外诱导实验，将HFSCs定向诱导为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞，验证HFSCs的多分化潜能;
　　3.证实HFSCs经过特殊共培养体系诱导后，可以分化为汗腺样细胞(sweatgland cells，SGCs)，并可参与汗腺(sweat gland，SG)的修复与再生;
　　4.以HFSCs为种子细胞构建结构和功能更趋于完整的组织工程全层皮肤。
　　方法:
　　1.分别用“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种方法体外分离HFSCs，并将毛囊组织或细胞植入铺有Ⅳ型胶原，以丝裂霉素C处理过的成纤维细胞为饲养层的transwell双层细胞培养板中，观察对比两组中细胞的形态、生长特性、及体外扩增能力的异同，并通过CD200、CD29、CK15等HFSCs特异性标记物的免疫细胞化学染色、免疫细胞荧光染色及流式细胞技术，分析、鉴定分离培养的HFSCs;
　　2.分别建立两种不同的体外细胞诱导体系，将HFSCs分别诱导分化为皮脂腺细胞、表皮细胞，并通过皮脂腺细胞及表皮细胞特异性标记物的免疫细胞化学、免疫细胞荧光染色及脂质的油红O染色，对诱导后细胞进行表型分析与鉴定;
　　3.体外分离培养人手掌或脚掌来源的SGCs及真皮间充质干细胞(dermalmesenchymal stem cells，d-MSCs)，利用transwell细胞培养板建立了一种特殊的HFSCs共培养体系，主要由热休克的SGCs及一种仿真皮结构的间质组织构成，我们又称之为间质饲养层(mesenchymal feeder layer，M-FL)主要包括:d-MSCs、Matrigel基质胶以及一定比例的优质胎牛血清(FBS)，同时设立两个对照组，对照组l中不包含热休克SGCs，对照组2中不包含M-FL;细胞经过诱导后，应用免疫细胞化学，免疫细胞荧光染色及流式细胞技术对诱导后细胞进行SGCs表型鉴定，对比实验组、对照组1、对照组2中细胞的表型变化情况，同时，通过台盼蓝拒染实验观察各组细胞的生长活性，Edu(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine)标记技术对比分析各组中细胞的增殖能力;
　　4.体外建立裸鼠脚掌烫伤模型，将HFSCs诱导来源的汗腺样细胞（induced-sweat gland cells，i-SGCs）移植到裸鼠脚掌的烫伤部观察，并以等量Nacl注射作为对照组，4周后，愈合创面全层皮肤取材，汗腺特异性标记物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白14(cytokeratin14，CK14)的免疫组化及免疫荧光染色分析判断，观察接受细胞移植的创面皮肤中是否有新生的汗腺结构存在;
　　5.蛋白印迹法(western bolt)、反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)检测分析HFSCs诱导前、后的外胚层发育不良(ectodermaldysplasia，EDA)基因及其受体（ectodermal dysplasia receptor, EDAR）的基因及蛋白表达的变化，以进一步探索HFSCs分化为SGCs的分子机制;
　　6.分别以HFSCs（A组），表皮干细胞(epidermal stem cells，ESCs)(B组)为种子细胞体外建立组织工程学全层皮肤，通过伊红-苏木素(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色分析两组标本形态结构的异同，观察A组标本中是否有毛囊样结构形成;两组标本分别进行integrinβ1(CD29)、细胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)免疫组织化学染色，观察阳性细胞分布多少及分布区域。
　　结果:
　　1.“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种细胞分离方法对比结果显示:应用前一种方法培养的第一代细胞生长至80-90％融合的时间为13～14天，而后一种方法为8～9天，但是传代后，从第二代细胞开始，两组细胞的生长速度及增殖能力无明显差异，无统计学意义(p＞0.05);
　　2.经过特异性微环境的诱导，HFSCs分别被诱导分化为上皮膜抗原(EMA)及油红染色阳性的皮脂腺细胞，以及细胞角蛋白10(cytokeratin10，CK10)阳性的角质形成细胞;
　　3.在HFSCs汗腺化诱导实验中，实验组中，有一部分HFSCs最终被定向诱导分化成为具有汗腺表型的细胞，对比之下，对照组1中没有细胞分化为SGCs.对照组2中只有极少部分细胞发生了向SGCs的转化;我们利用细胞的特异性标记物，通过免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定诱导后细胞，发现在这些细胞中HFSCs特异性标记物CD200、CD29及CK15的表达变弱了，而汗腺细胞特异性标记物CEA和CK14的表达却增强了，这说明HFSCs在设计的共培养微环境中可以实现向SGCs的分化;
　　4.western blot结果显示分化而来的SGCs高表达EDA和EDAR，RT-PCR及实时荧光定量PCR分析显示EDA基因及EDAR基因在诱导后SGCs中呈高表达状态;而CD29、CD200等HFSCs特异性抗原基因在汗腺化诱导后表达降低;
　　5.在随后的细胞移植实验中，接受了细胞注射的裸鼠烫伤脚掌的愈合创面，我们发现了类似SG的新生结构，进而行SGCs特异性标记物的免疫组织化学染色及免疫荧光染色，结果显示这些类似汗腺的结构对CEA、CK14呈阳性表达，而在Nacl注射组的创面标本中，没有发现这种类汗腺结构的存在。
　　6.在以HFSCs为种子细胞的A组及以ESCs为种子细胞的B组标本中，HE染色结果显示，两组标本均由表皮和真皮组成，二者之间以基底层相连接，基底层细胞排列较为整齐，细胞偏大，有CK19+和CD29+细胞散在分布;两组间标本对比显示:A组标本中，表皮层相对于B组较厚，分层较多，而且部分标本在基底层下方有毛囊样结构形成，表皮与真皮结合较紧密;B组标本对比A组来说，表皮层较薄，分层较少，表皮真皮易分离，基底层附近CK19+和CD29+阳性细胞较A组标本少，基底层下浅真皮层中无毛囊样结构形成。
　　结论:
　　1.HFSCs可以在体外适宜的微环境中被分离、培养、扩增;其中“酶消化-毛囊剥离-酶消化”法较“酶消化-毛囊剥离-直接种植”法缩短了原代细胞的培养时间，在实验中更具优势;
　　2.HFSCs具有多分化潜能，可以在体外被诱导分化为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞;
　　3.HFSCs可以在适宜的微环境中，被诱导分化为SGCs; HFSCs作为一种成体干细胞，有用于治疗汗腺缺失的潜能;我们建立的共培养诱导体系可以有效的将HFSCs定向诱导分化为SGCs，其分子机制与EDA/EDAR基因的激活有关;诱导分化而来的汗腺细胞是有功能的，可以参与皮肤创面中汗腺的再生;
　　4.以HFSCs为种子细胞有望构建出富含皮肤附属器的，形态、结构、功能更趋于完善的组织工程全层皮肤。