注射用益气复脉调节NF-κB介导的炎症信号通路缓解慢性心衰的作用研究

摘要

目的:明确注射用益气复脉对慢性心衰的疗效，并从抗炎角度探讨益气复脉及其有效成分治疗心衰相关机制，明确中药抗炎免疫调节有效成分，为其临床应用提供实验依据。
　　 方法:（一）动物药效研究:(1)心衰模型复制:采用结扎大鼠冠状动脉左前降支近端的方法建立心力衰竭大鼠模型。造模成功的大鼠随机分为模型组、益气复脉组和阳性药卡托普利组，只开胸穿线不造模的大鼠为假手术组。(2)注射用益气复脉对心衰大鼠防治作用的实验观察:所有动物均于给药8周后测定心率、心电图等血流动力学参数;进行心脏外观及心肌组织切片观察;腹主动脉取血，酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中心衰特异性指标BNP含量。(3)观察益气复脉对心衰大鼠炎症状态的影响:腹主动脉取血离心取血清，心肌组织裂解提取总蛋白，采用ELISA分别测定血清及组织中TNF-α、IL-6及IL-1β含量并进行比较分析。
　　 （二）活性物质筛选:采用超高压液相色谱/四级杆飞行时间质谱结合NF-κB转录活性双萤光素酶报告系统筛选益气复脉中治疗心衰的抗炎单体成分。转染试剂PEI将NF-κB和内参Renilla荧光素酶报告基因质粒共转染入HEK293细胞内，TNF-α刺激细胞建立炎症损伤模型。每半分钟富集益气复脉超高压液相流出液，适量浓度加入到NF-κB过度表达的HEK293细胞中，检测各组分对NF-κB的抑制作用。
　　 （三）活性物质抗炎通路确认:(1)探索益气复脉及有效成分对心肌微血管内皮细胞(CMECs)炎症损伤的保护作用:TNF-α损伤建立CMECs炎症模型，加入益气复脉及有效成分孵育后采用ELISA法分别测定细胞裂解液NF-κB及细胞上清IL-6及IL-1β含量并进行比较分析。(2)探索益气复脉及有效成分CMECs炎症损伤后相关基因和蛋白表达的影响:应用RT-PCR法检测CMECs中ERK、JNK和P38 mRNA含量的变化并采用ELISA法测定细胞内三种蛋白含量的变化。
　　 结果:（一）动物药效研究:(1)注射用益气复脉对大鼠心衰具有显著的防治作用:其可升高因心衰引起的心率过缓，显著降低心电图ST段，缩小心衰大鼠的心脏体积及心肌缺血面积，有效改善心肌组织形态及心功能，与阳性对照药卡托普利组效果基本相同。(2)注射用益气复脉可以改善大鼠慢性心衰的炎症状态，降低炎性细胞因子水平:慢性心衰大鼠血清及组织中炎性因子TNF-a，IL-1β，IL-6水平明显高于假手术组，益气复脉能显著降低TNF-a， IL-1β，IL-6的含量，从而发挥保护心肌内皮细胞的作用。（二）活性物质筛选:益气复脉对HEK293细胞NF-κB的高表达具有显著抑制作用，通过超高压液相色谱结合NF-κB转录活性双萤光素酶报告系统筛选出益气复脉中能够显著抑制NF-κB转录活性的8种单体成分，分别为人参皂苷Rb1，Rg1， Rf， Rh1， Rc，Rb2，Ro以及Rg3。（三）活性物质抗炎通路确认:(1)益气复脉及其主要活性成分对CMECs炎症损伤模型具有显著保护作用，可以降低细胞裂解液中NF-κB的含量以及细胞上清IL-1β、IL-6的含量。(2)益气复脉及主要活性成分可降低炎性CMECs中JNK和P38的基因及蛋白表达量，对ERK的表达水平无影响。
　　 结论:益气复脉对大鼠心力衰竭具有明显的治疗和改善作用，通过抑制NF-κB的过度激活及细胞因子的过度表达是其发挥保护作用的重要机制，其中人参皂苷Rb1，Rg1， Rf，Rh1，Rc，Rb2， Ro，以及Rg3对于益气复脉发挥抗炎免疫调节活性起了重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 慢性心力衰竭总述

第二节 慢性心力衰竭的发病机制研究

1．2．1 体液潴留学说

1．2．2 血液动力学学说

1．2．3 神经激素学说

1．2．4 心室重塑学说

第三节 慢性心力衰竭与炎症

1．3．1 核因子-κB

1．3．2 TNF-α

1．3．3 IL-1β

1．3．4 IL-6

第四节 慢性心力衰竭的常规西医治疗

1．4．1 强心利尿药物

1．4．2．血管扩张剂

1．4．3 心肌保护药物

第五节 中医治疗慢性心衰的研究进展

1．5．1 现代中医对慢性心衰的认识

1．5．2 当代医家对心衰辨证治疗概述

1．5．3 注射用益气复脉概述

第六节 本论文立题意义

第二章 注射用益气复脉对实验大鼠慢性心衰治疗作用研究

第一节 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 药物和试剂

2．1．3 主要仪器设备

第二节 实验方法

2．2．1 大鼠心衰模型建立与分组

2．2．2 注射用益气复脉对心衰大鼠心电图及心率的影响

2．2．3 注射用益气复脉对心衰大鼠血浆脑钠肽含量的影响

2．2．4 注射用益气复脉对心衰大鼠心脏外观形态的影响

2．2．5 注射用益气复脉对心衰大鼠心肌病理形态学的影响

2．2．6 注射用益气复脉对心衰大鼠血浆及心肌组织相关炎症因子的影响

第三节 结果与分析

2．3．1 注射用益气复脉对心衰大鼠心电图及心率的影响

2．3．2 注射用益气复脉对心衰大鼠血浆脑钠肽含量的影响

2．3．3 注射用益气复脉对心衰大鼠心脏外观形态的影响

2．3．4 注射用益气复脉对心衰大鼠心肌病理形态学的影响

2．3．5 注射用益气复脉对心衰大鼠血浆及心肌组织相关炎症因子的影响

第四节 小结与讨论

第三章 注射用益气复脉抗炎活性物质筛选

第一节 主要材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 试剂

第二节 实验方法

3．2．1 样品制备

3．2．2 细胞培养

3．2．3 双荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染

3．2．4 细胞实验分组及给药

3．2．5 NF-κB荧光活性检测

3．2．6 UPLC条件

3．2．7 UPLC分段样品的制备

3．2．8 质谱条件

3．2．9 物质结构鉴定

3．2．10 统计学分析

第三节 实验结果

3．3．1 注射用益气复脉对NF-κB的抑制作用研究

3．3．2 UPLC分段样品对NF-κB的抑制作用研究

3．3．3 人参皂苷单体活性验证及结构分类

第四节 小结与讨论

第四章 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的大鼠微血管内皮细胞(CMECs)的保护作用研究

第一节 实验材料

4．1．1 实验器材

4．1．2 实验试剂

4．1．3 细胞来源

第二节 实验方法

4．2．1 大鼠微血管内皮细胞(CMECs)的分离培养

4．2．2 大鼠微血管内皮细胞(CMECs)的鉴定

4．2．3 建立CMECs炎症损伤模型，考察不同浓度TNF-α对CMECs炎症因子的影响

4．2．4 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs的炎症水平影响

4．2．5 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs内ERKmRNA、JNK mRNA和P38 mRNA表达的影响

4．2．6 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs内ERK、JNK和P38蛋白表达的影响

第三节 实验结果

4．3．1 CMECs形态观察及鉴定

4．3．2 不同浓度TNF-α对CMECs细胞炎症水平的影响

4．3．3 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs的炎症水平影响

4．3．4 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs内ERKm RNA、JNK mRNA和P38 mRNA表达的影响

4．3．5 注射用益气复脉及活性单体对TNF-α损伤的CMECs内ERK、JNK和P38蛋白表达的影响

第四节 小结与讨论

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果