IRF3-EGFP为标记的筛选抗病毒药物细胞模型的建立

摘要

病毒感染宿主后，引发宿主的先天免疫和获得性免疫反应，可以有效终止病毒的入侵。作为抵御病毒第一道防线的先天免疫反应，其中一个关键性步骤是合成并分泌Ⅰ型干扰素(IFN)。先天免疫系统中的细胞可以表达模式识别受体(PRR)来识别病毒在宿主体内复制时产生的一些保守成分，即病原相关分子模式(PAMPs)。目前已经发现了三种PRR——Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLRs)和维甲酸诱导的基因Ⅰ样受体(RLRs)。其中TLR和RLR是识别病毒PAMP并诱导产生Ⅰ型IFN的主要受体。
　　 干扰素调节因子3（IFN Regulatory Factor3，IRF3）是干扰素调节因子家族的一个重要成员，在诱导IFN产生过程中起着重要作用。它在多种细胞中呈现高水平表达状态。它具有多个结构域，其中，转录活化结构域(TAD)的两侧是两个可以相互作用的自身抑制结构域(AID)。在IRF3未受到刺激时，AID彼此相互作用掩盖TAD，防止IRF3移位至细胞核与核内的DNA结合。IRF3在非感染的细胞中存在于胞质内，并且不与其他蛋白结合，以单体非活化形式存在。一旦受到上游信号转导，IRF3被磷酸化激活，分子内部的AID被打开，形成二聚体后进入细胞核，诱导Ⅰ型IFN的产生。
　　 本论文的研究中，建立了稳定表达IRF3-EGFP的HeLa细胞系，带有绿色荧光蛋白标记的IRF3可以在荧光显微镜下指示IRF3的定位。
　　 选取合适的感染滴度和时间，以单纯疱疹病毒(HSV)和水疱性口炎病毒(VSV)感染该细胞系，发现无论是野生型还是缺失34.5的HSV，均无法观察到IRF3大量入核。而VSV在MOI=5，感染时间为10小时的条件下，可明显观察到IRF3的入核。由此最终确定以VSV作为感染病毒筛选抗病毒药物的条件。该条件的确立为进一步筛选潜在具有抗病毒作用的化合物建立了基础。

目录

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摘要

缩略词表

第一章 引言

第一节 抗病毒天然免疫通路

1．1．1 病毒感染引发天然免疫通路的简介

1．1．2 基于RIG-I-MAVS信号途径的抗病毒反应

1．1．3 基于TLR-IRF3信号途径的抗病毒反应

第二节 干扰素调节因子IRF

1．2．1 IRF家族

1．2．2 IRF3的简介

第三节 药物筛选的策略

1．3．1 基于不同模型筛选抗病毒药物

1．3．2 细胞分子水平药物筛选模型常用的技术

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 主要溶液配方

2．1．4 主要仪器

第二节 实验原理与方法

2．2．1 实验原理

2．2．2 实验方法

第三章 实验结果

第一节 稳定表达IRF3-EGFP的HeLa细胞系的建立

3．1．1 G418浓度的确定

3．1．2 IRF3-EGFP稳定细胞系的筛选

第二节 稳定表达IRF3-EGFP的HeLa细胞系的验证

3．2．1 细胞系表达目的蛋白的验证

3．2．2 细胞系的荧光结果

第三节 建立针对RNA病毒的筛选药物的细胞模型

3．3．1 确定针对VSV的筛选条件

第四节 建立针对DNA病毒的筛选药物的细胞模型

3．4．1 确定针对HSV的筛选条件

3．4．2 确定针对R3616的筛选条件

第四章 结论

参考文献

致谢

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