一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型及应用

摘要

本发明涉及无标记G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞筛选模型构建方法及应用，具体地说是一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，利用GPR88稳定表达的细胞系，建立了筛选GPR88受体激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可用于研究影响受体下游通路的调节剂。本发明构建的GPR88细胞筛选模型不需荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂，具有靶点‑通路整合响应、对细胞无损伤、检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高、周期短及操作简便等特点。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合化学库中寻找GPR88受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及GPR88受体密切相关的中枢神经系统疾病，如精神分裂、帕金森病、焦虑症、抑郁症、药物成瘾等精神疾病的药物筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及无标记GPCR细胞筛选模型的构建方法，具体地说是一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型及应用。

背景技术

G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）是七次跨膜受体，其数量高达800个，介导从血压调节到无数重要的生理和病理过程，因此是小分子药物开发中最受关注的药物靶点[Allen, J. A., et al., Annual Review of Pharmacology andToxicology 2011, 51, 117−144.]。目前FDA批准的约40％的药物靶标为GPCRs，而且这些药物靶向的GPCRs只占总GPCRs的20%，还有大量的GPCRs，尤其是孤儿G蛋白偶联受体（orphan G-protein-coupled receptors, oGPCRs）依然未得到开发和利用[Rask-Andersen, M., et al., Nature Reviews Drug Discovery 2011, 10, 579−590；Wold,E. A., et al., Journal of Medicinal Chemistry 2019, 62(1), 88-127；Lu, S. etal., Journal of Medicinal Chemistry 2019, 62(1), 24-45；Topiol, S., Methods inMolecular Biology 2018, 1705, 1−21；Hauser, A. S., et al., Nature Reviews DrugDiscovery 2017, 16, 829−842；Chung, S., et al., British Journal ofPharmacology 2008, 153 (S1), S339；Fang, Y., et al., Frontiers in Pharmacology2015, 6, 295；Kroeze, W. K., et al., Nature Structural & Molecular Biology2015, 22, 362−369.]。G蛋白偶联受体-88（GPR88），是GPCRs家族的一员，在纹状体、尾状核、伏隔核和嗅结节中表达，其中枢神经系统在纹状体中的表达特别强，与多巴胺D2受体的表达相当[Mizushima, K. , et al., Genomics 2000, 69, 314.]。研究表明，GPR88涉及调节各种大脑和行为功能，包括认知，情绪，运动控制和基于奖励的学习，因此正成为治疗中枢神经系统疾病（包括精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾病）的新型药物靶标，但是目前GPR88的内源性配体仍然未知[Massart, R., et al., EuropeanJournal of Neuroscience 2009, 30, 397−414；Jin, C. Y. , et al., Acs ChemicalNeuroscience 2014, 5(7), 576-587；Jin, C. Y. , et al., Acs ChemicalNeuroscience 2016, 7(10), 1418-1432；Ye, N., et al., Acs Chemical Neuroscience2019, 10(1), 190-200]。鉴于GPR88对于中枢神经系统疾病的巨大治疗潜力，构建GPR88受体的细胞筛选模型，用以发现GPR88受体的内源性配体、高活性激动剂、拮抗剂及通路调节剂，对揭示GPR88的生物学功能和药理学特征，以及推进中枢神经系统疾病新型靶标药物的发展具有重大意义。

目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、GTPγS结合实验法、环磷酸腺苷（cAMP）分析法、钙流检测法、报告基因检测法、受体的内吞检测法及β-arrestin的招募检测法等[Bylund, D. B., et al., American Journal ofPhysiology 1993, 265, L421-L429；Harrison, C., et al., Life Sciences 2003, 74,489-508；Zhang, R., et al., Acta Pharmacologica Sinica 2012, 33, 372-384；Emkey, R., et al., in: Janzen, W. P., et al. (Eds.), High ThroughputScreening: Methods and Protocol, Second Edition；Fan, F., et al., Assay andDrug Development Technologies 2007, 5, 127-136；Zanella, F., et al., Trends inBiotechnology 2010, 28, 237-245；Luttrell, L. M., et al., Journal of CellScience 2002, 115, 455-465.]。但这些方法都有一定的局限性，如传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术也不能区分受体的激动剂和拮抗剂；其余的GPCR检测方法主要针对某条信号通路的激活，对多条通路的激活无法区别，需要荧光蛋白标记或者额外加入指示剂，操作繁琐，而且指示剂的加入对细胞也会产生一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型，以高通量筛选GPR88受体内源性配体、激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及GPR88受体密切相关的中枢神经系统疾病，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾病的药物筛选应用。

本发明的技术方案为：

基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达GPR88的细胞系HEK293T-GPR88，借助于已知的激动剂，建立GPR88受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂的DMR特征信号谱的相似性和特异性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性，或者对下游通路的调节影响。

其中，所述的无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅（RWG）生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值（pm），通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。模型的建立过程为：

1)在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK293T-GPR88细胞，接种的细胞密度为1.0 ~ 4.5 × 10

2)将溶解在HBSS缓冲盐中的GPR88受体激动剂2-PCCA以浓度为2.4 ~ 20000 nM加入到接种HEK293T-GPR88细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

3)向步骤2)中加了GPR88受体激动剂2-PCCA的HEK293T-GPR88细胞的384微孔板中继续加入具有最高响应强度对应的最低浓度（EC

4)获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性。

其中，所述待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：

1)将溶解在HBSS缓冲盐中的GPR88受体激动剂2-PCCA以浓度为2.4 ~ 20000 nM加入到接种HEK293T-GPR88细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

2)将待测样品以浓度为0.01 nM ~ 100 µM加入到接种HEK293T-GPR88细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；

3)关联分析步骤1）和步骤2）中的DMR信号谱，若步骤2）的DMR信号谱与1）中的DMR特征谱具有轮廓相似性，则进行下一步骤；

4)向步骤2)中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1)中相同浓度的2-PCCA，检测DMR信号谱；若此DMR信号比步骤1)中2-PCCA的信号弱。

5)向步骤1)加入GPR88受体激动剂2-PCCA的接种HEK293T-GPR88细胞的384微孔板中，继续加入与步骤2)中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号强度低于步骤2)中的DMR信号强度，则判断此样品为GPR88受体的激动剂。

其中，所述待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：

1)将待测样品和2-PCCA分别加入到接种HEK293T-GPR88细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01 nM ~ 100 µM，2-PCCA浓度为2.4 ~ 20000 nM，检测DMR信号谱；

2)若步骤1）中待测样品不引起DMR信号谱，向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的2-PCCA，检测DMR信号谱；若此DMR信号比步骤1）中2-PCCA的信号弱，可判断待测样品是GPR88受体的拮抗剂。

其中，所述待测样品对GPR88通路有调节活性的步骤如下：

1)将待测样品和2-PCCA分别加入到接种HEK293T-GPR88细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01 nM ~ 100 µM，2-PCCA浓度为2.4 ~ 20000 nM，检测DMR信号谱；

2)再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的2-PCCA，检测DMR信号谱，检测时间为1 ~ 120 min；若此DMR信号比步骤1）中2-PCCA的信号在上升期、平台期和延滞期某一个阶段不同；

3)将GPR88受体激动剂2-PCCA以浓度2.4 ~ 20000 nM加入到接种HEK293T-GPR88细胞的微孔板中，预处理1 ~ 120 min，加入与步骤1）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号谱与步骤1）中的样品的DMR信号谱一致，可判断待测样品是GPR88受体下游信号通路的调节剂。

其中，所述上升期为1 ~ 30min、平台期为30 ~ 60min和延滞期为60 ~ 120min。

本本发明建立的一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型，可为对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物进行高通量筛选，获得GPR88受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂。此外，根据靶点与疾病的相关性，发现GPR88受体在神经系统疾病，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾病中发挥重要作用，也可开展相关疾病的药物筛选。

附图说明

图1 （A）不同浓度的2-PCCA在HEK293T-GPR88细胞上的DMR特征信号谱；（B）不同浓度的2-PCCA在HEK293T-GPR88细胞上的浓度-响应依赖曲线。

图2 （A）不同浓度的2-PCCA预处理HEK293T-GPR88细胞2 h后，固定浓度2-PCCA的DMR信号谱；（B）不同浓度的2-PCCA预处理HEK293T-GPR88细胞2 h后，固定浓度2-PCCA的DMR信号谱对应的浓度-响应依赖曲线。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：GPR88受体激动剂2-PCCA在HEK293T-GPR88细胞上的DMR特征信号谱

人胚肾细胞HEK293T-GPR88细胞来源于中国科学院大连化学物理研究所，倒置显微镜购于OLYMPUS，2-PCCA（货号：HY-100013C）购于MedChemExpress公司。细胞培养板为Epic光学生物传感384微孔板，购于康宁公司，检测平台为康宁第三代Epic®成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置（DMR）引起的波长位移。

将处于对数生长期的HEK293T-GPR88细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，所用培养基为DMEM（#SH30022.01B, Thermo），每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为3.0×10

实验结果表明2-PCCA激活GPR88受体产生DMR信号响应，且呈现剂量依赖，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，最高的DMR响应值达300 pm，其EC

实施例2：HEK293T-GPR88细胞的脱敏DMR特征信号谱

将处于对数生长期的HEK293T-GPR88细胞，接种于细胞兼容的384微孔板中，所用培养基为DMEM（#SH30022.01B, Thermo），每孔的接种体积为40 µL，每孔接种的细胞数目为3.0×10

实验结果表明2-PCCA呈剂量依赖地脱敏GPR88受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，其的IC

本发明基于无标记细胞整合药理学技术，建立了GPR88无标记筛选模型，此模型具有不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂的优势，高效可靠的筛选商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物，以获得GPR88受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂及GPR88受体密切相关的中枢神经系统疾病，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症和成瘾症等精神疾病的药物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限。