肝组织工程用甘草次酸修饰壳聚糖硫酸酯酶交联水凝胶支架材料的制备及性能研究

摘要

体外制备一种可移植的人工肝脏的肝组织工程，为恶性肝病的治疗带来了希望。肝组织工程的主要问题一是用于肝组织工程的支架要能诱导体内的血管新生，为新生的肝组织提供足够的氧气和营养物质，一是要能为肝细胞提供一个良好的生长环境，保证新生肝组织具有正常的肝功能。因此，本文从提高支架诱导血管新生能力和提高支架的肝细胞亲和性两方面出发，制备了一种含有对细胞有特异性结合性的甘草次酸(GA)的肝组织工程支架材料。
　　 首先通过共价修饰制备了甘草次酸修饰的壳聚糖硫酸酯(SCTS-GA)、可酶交联的对羟基苯丙酸修饰的壳聚糖硫酸酯(SCTS-HPA)，制备了壳聚糖(CTS)、羧甲基壳聚糖(CMCTS)、壳聚糖硫酸酯(SCTS)、SCTS-GA修饰的玻璃片材料，并在辣根过氧化物酶/过氧化氢(HRP/H2O2)存在制备了凝胶性能简单可调的酶交联水凝胶。
　　 为了考察SCTS-GA材料的诱导血管新生能力，我们体外研究了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在CTS、CMCTS、SCTS、SCTS-GA上的粘附和增殖行为，发现SCTS有更好的细胞亲和性，并且GA的引入对增强了HUVEC粘附和增殖能力。体内研究了CTS、CMCTS、SCTS、SCTS-GA支架诱导血管新生的能力，结果显示SCTS能很好的诱导组织长入和血管新生，并且GA的引入对SCTS支架的诱导血管新生能力有一定的加强作用。与此同时，发现CTS、CMCTS支架在实验过程中因支架凝血造成了支架植入部位的皮肤坏死，经过分析我们发现具有抗凝血特性的SCTS可通过抑制血小板粘附表达抗凝血特性，从而保证了血管支架材料的安全性。
　　 为了考察SCTS-GA作为肝组织工程支架材料的可行性，我们首先以易得的HepG2细胞考察了SCTS-GA对HepG2细胞的粘附和增殖行为的影响，结果显示含有GA的材料表现出了良好的细胞亲和特性。然后，我们制备了含有GA的多孔支架材料SCTS-GA，考察了支架中GA对原代鼠肝细胞功能的维持和球体形成的影响，结果显示，含有GA的支架材明显的促进了细胞的白蛋白、尿素的合成水平和支架中细胞球体的形成。
　　 综上所述，我们用能够很好的诱导内皮细胞粘附和增值、具有一定的抗凝血特性和良好的组织相容性、诱导支架中血管形成的SCTS作为基质材料，并用对肝细胞的功能维持和球体结构形成有促进作用的GA为活性基团，制备了一种肝组织工程支架材料，有望为肝组织工程提供帮助。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 肝组织工程发展面临的困难

第二节 肝病的治疗方法

1．2．1 肝组织工程发展现状

第三节 诱导组织工程支架微血管化的方法

1．3．1 诱导支架血管化的过程

1．3．2 诱导支架内血管新生的研究进展

第四节 材料的选择

第五节 课题提出

第二章 SCTS-GA支架材料的制备和表征

第一节 引言

第二节 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 壳聚糖硫酸酯(SCTS)的合成

2．2．3 对羟基苯丙酸修饰的壳聚糖硫酸酯(SCTS-HPA)的合成

2．2．4 对羟基苯丙酸修饰的羧甲基壳聚糖(CMCTS-HPA)的合成

2．2．5 甘草次酸修饰的壳聚糖硫酸酯(SCTS-GA)的合成

2．2．6 SCTS、SCTS-HPA、CMCTS-HPA、SCTS-GA材料表征

2．2．7 SCTS及其衍生物材料修饰玻璃片的修饰

2．2．8 SCTS及其衍生物材料修饰玻璃片的表征

2．2．9 酶交联壳聚糖硫酸水凝胶的制备和凝胶时间测定

2．2．10 凝胶机械性能测定

2．2．11 冻干凝胶支架形貌分析

2．2．12 凝胶细胞毒性分析

2．2．13 SCTS-GA支架的制备和表征

第三节 结果与讨论

2．3．1 SCTS的产物表征

2．3．2 SCTS-HPA的产物表征

2．3．3 CMCTS-HPA的产物表征

2．3．4 GA-suc的产物表征

2．3．5 SCTS-GA的产物表征

2．3．6 SCTS及其氧生物材料修饰玻璃片的表征

2．3．7 凝胶性能测试

2．3．8 SCTS-GA支架SEM表征

第四节 本章小结

第三章 SCTS-GA材料诱导支架血管新生能力研究

第一节 引言

第二节 实验部分

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 SCTS-GA对内皮细胞行为的影响

3．2．3 SCTS-GA体内诱导血管新生能力评价

3．2．4 PT和APTT实验

3．2．5 血小板聚集和血小板粘附实验

第三节 结果与讨论

3．3．1 SCTS GA内皮细胞行为的影响

3．3．2 支架组织切片观察

3．3．3 支架诱导血管数量统计

3．3．4 材料凝血现象分析

第四节 本章小结

第四章 SCTS-GA作为肝组织工程支架材料的可行性分析

第一节 引言

第二节 实验部分

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 通过人肝癌细胞探讨SCTS-GA支架在肝组织工程中的应用

4．2．3 通过鼠原代肝细胞探讨SCTS-GA在肝组织工程中的应用

第三节 结果与讨论

4．3．1 通过人肝癌细胞探讨SCTS-GA支架在肝组织工程中的应用

4．3．2 通过鼠原代肝细胞探讨SCTS-GA支架在肝组织工程中的应用

第四节 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果