表达CD20单链抗体的溶瘤痘苗病毒的构建及研究

摘要

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤的一种，约占三分之一左右。因其具有较高的异质性，在临床上治愈率极低。1997年美国FAD首次批准针对B细胞表面抗原CD20的单克隆抗体Rituximab应用于治疗B细胞淋巴瘤并取得了良好的临床效果。CD20(B1或Bp35)是定位于B细胞表面并涉及B细胞分化的一类穿膜蛋白。CD20在正常B细胞及95％以上的恶性B细胞中都有表达，但在造血干细胞和浆细胞中并不表达，是调节B细胞增殖和分化信号途径的一部分。由于上述的结构和组织特异分布特点，使CD20成为是治疗恶性B细胞淋巴瘤的良好的单克隆抗体靶位点。
　　 本实验在TK天然突变的Western Reserve株痘苗病毒基础上通过scFv与HA蛋白跨膜区及胞内区融合的方式成功构建了表达有anti-CD20 scFv的减毒重组痘苗病毒。Elisa实验证明，重组病毒表达的anti-CD20 scFv与天然的CD20抗原具有一定的结合能力。同时，体外实验证明，表达scFv同时HA缺失的重组病毒与HA天然移码突变的痘苗病毒相比，对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系Ly19（CD20阳性恶性细胞）具有更强的感染力。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

第一节 溶瘤病毒的背景

1．1．1 溶瘤病毒(Oncolytic virus)的概念

1．1．2 溶瘤病毒的溶瘤机制

1．1．3 溶瘤病毒的肿瘤选择性机制

1．1．4 现阶段应用于临床的溶瘤病毒种类

1．1．5 溶瘤病毒治疗肿瘤面临的挑战和解决方法

第二节 痘苗病毒的背景及溶瘤痘苗病毒的背景

1．2．1 痘苗病毒的疫苗背景

1．2．2 痘苗病毒的生物学背景

1．2．3 痘苗病毒作为溶瘤病毒载体的优点

1．2．4 常用的溶瘤痘苗病毒株系

1．2．5 痘苗病毒的肿瘤趋向机制

第三节 痘苗病毒A56R及其相关蛋白的背景

1．3．1 痘苗病毒A56R(hemagglutinin，HA)蛋白

1．3．2 与HA成复合物的相关蛋白

1．3．3 HA与痘苗病毒毒力

1．3．4 HA敲除病毒与溶瘤病毒

第四节 弥漫大B细胞淋巴瘤相关抗原极其抗体治疗的研究进展

第五节 单链抗体的概念及其结构的简单介绍

第六节 本研究的的研究背景和研究内容

第二章 实验材料及实验方法

第一节 实验材料

2．1．1 实验所用细胞，病毒株系及痘苗病毒打靶质粒

2．1．2 实验耗材与仪器设备

2．1．3 常用实验试剂购买

2．1．4 常用试剂的配制

第二节 实验方法

2．2．1 KS-HA质粒的构建

2．2．2 PSC-HA-3质粒改造流程图

2．2．3 PSC-HA-1质粒的构建

2．2．4 PSC-HA-2的构建

2．2．5 PSC-HA-3的构建

2．2．6 采用overlap的方式构建Anti-CD20 scFv和HA蛋白融合基因

2．2．7 PSC-HA-3-scFv-HA质粒的构建

2．2．8 CV-1细胞的复苏，冻存及传代

2．2．9 痘苗病毒的重组

2．2．10 0．5％鸡红细胞的提取

2．2．11 重组痘苗病毒及天然HA突变痘苗病毒的初步筛选

2．2．12 根据病毒空斑形态的不同对重组痘苗病毒进行筛选

2．2．13 病毒的大量培养及收集

2．2．14 HA重组病毒的PCR验证

2．2．15 HA天然突变痘苗病毒的PCR验证

2．2．16 病毒滴度的测定

2．2．17 重组病毒的免疫荧光

2．2．18 LY-9细胞的换液与传代

2．2．19 超声破碎法LY19膜蛋白的提取

2．2．20 HA+痘苗病毒的Elisa测定

2．2．21 CD20单链抗体与CD20抗原Elisa的验证

2．2．22 病毒对Y19细胞杀伤力的检测

第三章 实验结果

3．1．1 KS-HA质粒的构建

3．1．2 PSC-HA-1质粒的构建

3．1．3 PSC-HA-2质粒的构建

3．1．4 PSC-HA-3质粒的构建

3．1．5 Anti-CD20 scFv HA蛋白融合基因的构建

3．1．7 重组痘苗病毒及天然A56R突变痘苗病毒的筛选

3．1．8 HA重组病毒及HA天然突变病毒的PCR鉴定

3．1．9 HA+痘苗病毒和△HA痘苗病毒的空斑观察比较

3．1．10 重组痘苗病毒的免疫荧光(anti-HA)

3．1．11 Elisa验证病毒anti-CD20 scFv与CD20抗原结合活性

3．1．12 重组病毒对Ly19细胞杀伤力的检测

第四章 实验讨论

结论

参考文献

致谢

附录

个人简历