哺乳动物细胞中EB1磷酸化的质谱鉴定及功能分析

摘要

末端结合蛋白EB1是一种微管正末端追踪蛋白（+TIPs），能够自发地定位于微管的正末端而不依赖于其它任何分子。同时，EB1作为一个平台，还能够将多种其他的+TIPs募集到微管的正末端。EB1由268个氨基酸残基组成。N端是CH结构域，负责介导EB1与微管的相互作用;C端是包含有EBH结构域的卷曲螺旋结构域，负责介导EB1的二聚化，并介导EB1与其他+TIPs的相互作用;中间无定型结构的连接区将EB1的N端和C端连接起来。EB1对于微管的动态性有重要调节作用，并进而参与微管介导的许多细胞活动，如细胞极化、细胞运动、细胞有丝分裂等。但是，EB1功能的调节机制还不清楚，阐明此问题有助于深入了解EB1介导的细胞活动。
　　本课题希望通过对EB1磷酸化的研究，来揭示EB1功能的调节机制。首先，本课题通过质谱的方法对在HeLa细胞系中过表达的GST-EB1蛋白进行检测，发现S27、T33、Y71、T135/S140、T154/S155/S156/S157、T165/S166、T206和Y217等一系列磷酸化位点。然后，根据质谱结果的可靠性和三维晶体结构分析，本课题选择部分位点进行进一步研究。通过点突变的方法将鉴定出来的磷酸化位点突变为不能磷酸化的形式和模拟磷酸化的形式。通过生物化学和细胞生物学的实验手段，本课题发现EB1磷酸化不影响EB1与微管蛋白的相互作用，而且不影响EB1定位于微管正末端的模式。通过激光共聚焦显微镜进行活细胞拍摄发现，EB1磷酸化促进微管的动态性，促进微管平均生长速度，并促进微管平均生长长度。Y217磷酸化使EB1定位于微管正末端的能力减弱。Y217磷酸化还破坏EB1与MCAK、APC、CLIP170、p150Glued等+TIPs的相互作用，并破坏EB1自身二聚化的能力。但是，进一步的实验表明，Y217磷酸化不改变细胞周期，且不影响有丝分裂纺锤体的定向和长度以及星体微管的密度。最后，我们发现Y217磷酸化使EB1蛋白质更稳定。由于Y217磷酸化提高EB1单体与二聚体的比例，此结果表明EB1单体比EB1二聚体更稳定。
　　本课题的研究结果表明，在哺乳动物细胞中，磷酸化在EB1蛋白上是广泛存在的，并且磷酸化对EB1的功能有重要的调节作用。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 EB1简介

1．1．1 EB1发现

1．1．2 EB1结构

1．1．3 EB家族

第二节 EB1与微管

1．2．1 微管(细胞骨架)

1．2．2 EB1定位

1．2．3 EB1和l+TIPs

1．2．4 EB1二聚体

第三节 EB1功能与调节

1．3．1 EB1功能

1．3．2 EB1功能调节

第四节 研究的目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 细胞系和菌株

2．1．2 质粒构建

2．1．3 抗体

2．1．4 试剂

2．1．5 仪器

2．1．6 常用实验溶液配方

第二节 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞转染

2．2．3 免疫印迹(Western Blotting)

2．2．4 考马斯亮蓝染色

2．2．5 胶上酶解

2．2．6 HeLa细胞周期同步化

2．2．7 流式细胞仪检测细胞周期

2．2．8 点突变

2．2．9 GST下拉实验

2．2．10 免疫荧光

2．2．11 活细胞拍摄

第三章 结果与分析

第一节 质谱鉴定HeLa细胞中EB1磷酸化位点

第二节 质谱鉴定HeLa细胞有丝分裂各时期EB1磷酸化位点

第三节 EB1磷酸化位点突变及磷酸化抗体检测

第四节 磷酸化不影响EB1与微管蛋白的相互作用及EB1的定位

第五节 EB1磷酸化对微管动态性的影响

第六节 磷酸化对EB1与+TIPs相互作用的影响

第七节 Y217磷酸化不影响细胞有丝分裂

第八节 Y217磷酸化降低EB1的稳定性

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果