白藜芦醇对大鼠心脏缺血—再灌注损伤保护机制的研究

摘要

目的:心脏的缺血一再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤是临床上一种常见的病理生理过程。已有的研究报道，白藜芦醇对大鼠心脏的缺血-再灌注损伤具有保护作用，但其机制没有被完全阐明。本文主要从细胞和离体两方面来探讨白藜芦醇对心脏I/R损伤的保护机制。
　　方法:利用鱼藤酮处理大鼠心肌细胞(H9c2)，制成I/R细胞模型，利用Calcein-AM，PI荧光染色评估白藜芦醇对缺血再灌注损伤的保护作用，siRNA抑制基因表达，DCFA荧光染色检测ROS的产生，并利用AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡;取雄性SD大鼠的离体心脏进行langendorff灌流实验，分别记录缺血前后+dp/dt，-dp/dt、LVDP、LVEDP及心率的变化;ELISA试剂盒检测大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)的释放量，石蜡切片HE染色检测心脏组织的损伤，并用TTC染色法检测心脏的梗死面积。综合运用Real-timePCR和Western blot技术，在心脏组织和细胞水平检测抗氧化基因MnSOD及相关蛋白的表达。
　　结果:与未治疗组相比，白藜芦醇可以明显抑制H9c2细胞的死亡、凋亡和ROS的产生;在心脏的灌流心脏中，白藜芦醇组大鼠的心脏功能明显改善，与此同时，灌流液中CK-MB的释放、心脏的损伤及心脏的梗死面积明显减小;在细胞及组织水平上，VEGF-B和MnSOD的mRNA及蛋白表达和Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平均明显增加;沉默VEGF-B后，抑制了VEGF-B/Akt/GSK3β/MnSOD信号通路，白藜芦醇对H9c2心肌细胞的保护作用明显减弱，而沉默SIRT1后，对VEGF-B的表达没有影响。
　　结论:白藜芦醇可以通过上调VEGF-B的表达，激活VEGF-B/Akt/GSK3β信号通路，继而上调抗氧化基因MnSOD，减少ROS的产生，保护心脏I/R损伤，并且白藜芦醇上调VEGF-B与激活SIRT1通路无关。

目录

声明

摘要

英汉缩略名词对照表

第一章 引言

1．1 缺血再灌注损伤

1．2 白藜芦醇(Resveratrol)

1．3 缺血再灌损伤中相关的调控基因

1．3．1 沉默信息调节因子1(SIRT1)

1．3．2 血管内皮生长因子B(VEGF-B)

1．3．3 糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)

1．3．4 蛋白酶B(serine-threonine kinase，Akt)

1．3．5 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)

第二章 材料、试剂和方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．1．1 主要实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验主要溶液的配制

2．2．1 动物实验相关溶液的配制

2．2．2 培养细胞溶液配制

2．2．3 TTC染液的配制

2．2．4 细胞染液的配制

2．2．5 Western-blotting相关溶液的配制

2．2．6 细胞模拟缺血再灌注模型溶液的配制

2．3 实验方法

2．3．1 动物实验

2．3．2 细胞实验

2．3．3 基因mRNA表达水平检测相关实验

2．3．4 Western-blotting检测蛋白的表达及活性相关实验

2．4 数据统计

第三章 实验结果

3．1 白藜芦醇对离体大鼠心脏灌流的影响

3．1．1 白藜芦醇预处理对离体心脏血流动力学的影响

3．1．2 白藜芦醇预处理对离体心脏肌酸激酶同工酶(CK-MB)释放水平的影响

3．1．3 白藜芦醇预处理对离体心脏缺血再灌注损伤梗死面积的影响

3．1．4 组织形态学观察白藜芦醇预处理对离体心脏缺血再灌注损的保护

3．2 白藜芦醇对H9c2细胞缺血再灌损伤的的影响

3．2．1 模拟再灌注损伤模型的建立和实验分组

3．2．2 白藜芦醇对H9c2细胞缺血再灌注损伤导致的细胞死亡的影响

3．2．3 白藜芦醇对H9c2细胞缺血再灌注后ROS产生的影响

3．2．4 白藜芦醇对H9c2细胞缺血再灌注后细胞凋亡的影响

3．3 白藜芦醇对大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护机制的研究

3．3．1 白藜芦醇对离体心脏和H9c2细胞VEGF-B表达的影响

3．3．2 白藜芦醇对离体心脏和H9c2细胞Akt和GSK3β蛋白活性的影响

3．3．3 白藜芦醇对离体心脏和H9c2细胞抗氧化系统的影响

3．3．4 siRNA干扰掉VEGF-B后白藜芦醇对H9c2细胞抵抗缺血再灌的影响

3．3．5 siRNA干扰掉SIRT1白藜芦醇对H9c2细胞VEGF-B蛋白表达的影响

第四章 讨论

4．1 白藜芦醇保护大鼠心脏缺血再灌注损伤新的信号通路探索

4．2 新的信号通路和经典信号通路可能相互作用的机制

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历