KLF5第369位赖氨酸的修饰鉴定及其对KLF5蛋白复合体组成和功能的影响

摘要

KLF5作为一种基础转录因子可以通过介导多条信号通路，在细胞的增殖、分化等方面发挥作用。研究表明KLF5的异常去乙酰化可以干扰细胞的分化，导致增殖失控，进而诱发癌变。KLF5第369位点存在乙酰化修饰，前期研究结果显示该位点突变型KLF5-K369R可以逆转正常KLF5的功能，使KLF5由原本的抑制增殖转变为促进增殖。故本实验旨在探明KLF5行使不同功能的潜在分子机制。
　　方法：利用 CCK-8增殖检测及细胞周期实验对 KLF5野生型和突变型KLF5-K369R影响增殖的不同表型进行体外功能验证；其次分别以PLHCX和pSin为载体构建两套带有标签的质粒 PLHCX-EGFP-His， PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His以及pSin，pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR过表KLF5和突变型KLF5-K369R，通过病毒包装感染目的细胞DU145和PC-3获得稳转过表达的多克隆细胞系；免疫沉淀实验富集KLF5及其相关作用蛋白，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并进行硝酸银染色，将之与对照组区分出的不同条带切下，质谱检测。
　　结果：体外增殖验证实验结果表明，KLF5可以抑制前列腺癌细胞系DU1451和 PC-3的增殖，但其突变型 KLF5-K369R可以阻碍这种增殖抑制，甚至表现出了一定程度的促进增殖；PLHCX-EGFP-His，PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His以及pSin，pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR质粒构建完成且在293T细胞中成功瞬时转染过表达KLF5及标签蛋白，但PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His在DU145稳定转染细胞中未检测出His标签，故不能用于后续实验；pSin，pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR已获得了DU145的稳定多克隆细胞系，免疫沉淀实验证明了阳性对照WWP1与KLF5有相互作用，证明KLF5已结合其相关作用蛋白。本实验已完成了 KLF5第369位点蛋白修饰质谱鉴定前期的细胞和样品准备及条件探索，为进一步质谱鉴定具体的蛋白修饰奠定了基础。

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符号及缩略语说明

第一章 引言

第一节 KLF5简介

1.1.1 KLF5基因和蛋白质结构

1.1.2 KLF5的功能

1.1.3 KLF5蛋白的翻译后修饰

1.1.4 KLF5的相互作用蛋白

1.1.5 KLF5调控的直接下游靶基因

第二节 蛋白质翻译后修饰的重要作用及其鉴定

1.2.1 蛋白质翻译后修饰的种类

1.2.2 蛋白修饰的鉴定

第二章 研究背景及研究目标

第一节 研究背景

2.1.1 KLF5既可以促进癌细胞增殖又可以抑制癌细胞增殖

2.1.2 KLF5通过结合不同转录辅激活因子形成不同的转录复合体行使功能

2.1.3乙酰化作用在裸鼠成瘤实验中得到证实，野生型KLF5与K369位点乙酰化缺陷型突变体功能反转

2.1.4 乙酰化KLF5与非乙酰化KLF5行使不同功能的潜在影响分子

第二节 研究目标及假设

第三节 实验思路

第三章 材料与方法

第一节 实验材料

3.1.1细胞系

3.1.2载体

3.1.3引物

3.1.4 主要试剂及试剂盒

3.1.5实验仪器

第二节 实验方法

3.2.1细胞培养

3.2.2 质粒构建

3.2.3 病毒包装

3.2.4 病毒感染

3.2.5转基因多克隆细胞系筛选

3.2.6 RNA提取及浓度测定

3.2.7 反转录PCR及定量PCR检测

3.2.8 免疫沉淀

3.2.9Western Blotting

3.2.10 细胞周期检测

3.2.11 CCK-8细胞增殖检测

3.2.12数据处理

第四章 实验结果

第一节 体外实验验证KLF5野生型和突变型KLF5-K369R影响增殖的不同表型

4.1.1验证野生型KLF5和K369位点去乙酰化突变体K369R在前列腺细胞DU 145及PC-3中获得稳定过表达

4.1.2 CCK-8实验检测KLF5野生型与突变型KLF5-K369R的增殖能力改变

4.1.3 细胞周期的检测增殖

第二节 利用His标签富集KLF5及其相关作用蛋白

4.2.1 构建PLHCX-EGFP-His，PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His质粒

4.2.2 293T细胞瞬时转染PLHCX-EGFP-His，PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His质粒检测KLF5及His标签过表达

4.2.3DU 145细胞中建立稳转PLHCX-EGFP-His，PLHCX-KLF5-His和PLHCX-KR-His质粒的多克隆细胞系检测

第三节 利用FLAG标签富集KLF5及其相互作用蛋白

4.3.1 构建pSin，pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR质粒

4.3.2 293T细胞中瞬时转染pSin，pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR质粒检测KLF5与FLAG标签过表达

4.3.3293T细胞系、PC-3细胞系和DU 145细胞系中稳转pSin， pSin-FLAG-KLF5和pSin-FLAG-KR质粒建立过表达KLF5和FLAG标签的多克隆细胞系检测

4.3.4 免疫沉淀（IP）实验富集KLF5相互作用蛋白

4.3.5 硝酸银染色区分蛋白质条带

第五章 讨论

5.1 体外功能实验与裸鼠成瘤体内实验结果的表型差异

5.2 带有His标签质粒的构建及功能检测失败的原因分析

5.3 带有FLAG标签的质粒稳转情况

第六章 结论与展望

第一节 结论

6.1.1 在体外条件下，KLF5第369位点的突变型KLF5-K369R可以影响KLF5抑制癌细胞增殖的功能，从而使KLF5的抑癌效果减弱，但不能完全逆转

6.1.2 本实验初步探索了KLF5相关结合蛋白，为质谱检测打下基础

第二节 展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的论文