ATOH8异构体促进乳腺癌的转移及Ifit1对LPS/GalN诱导的致死性肝炎的保护作用研究

摘要

第一部分
　　乳腺癌是女性中最常见的肿瘤，其发病率居于所有女性肿瘤的首位。肿瘤转移是乳腺癌病人死亡的首要原因，占所有死亡病例的90％左右，是目前肿瘤研究和临床治疗的难点和热点。乳腺癌的远端转移是一个复杂而有序的过程，主要包括局部浸润（Local invasion），穿过血管或淋巴管壁（Intravasation），随循环系统到达远端部位，穿出血管或淋巴管（Extravasation）以及定植生长形成继发灶等几个过程。
　　bHLH转录因子构成了真核生物蛋白质中的一个大的家族，称为bHLH超家族，该家族的成员在机体的发育过程中具有重要的作用。很多 bHLH转录因子在肿瘤的发生和进展，尤其是在肿瘤转移的过程中发挥着非常重要的作用。ATOH8是bHLH转录因子家族的一个成员，在胚胎发育期间广泛表达于多种器官或组织，并参与这些组织中相应细胞的分化过程。研究表明，ATOH8可以促进内皮细胞的分化，诱导新生血管的形成，同时对内皮细胞的运动能力也有一定的调节作用。此外，ATOH8可以调节Oct4和Nanog的表达，影响细胞的干性。鉴于 ATOH8的这些生物学活性与肿瘤的发生发展，尤其是转移关系密切，我们猜测ATOH8在肿瘤转移过程中具有重要作用，可以促进乳腺癌的转移。
　　首先，为了探索ATOH8与肿瘤之间的关系，我们用qPCR和Western Blot的方法检测了乳腺癌细胞系中ATOH8的表达，发现ATOH8的表达水平与肿瘤细胞的恶性程度呈正相关。随后，我们用Lentivirus系统在乳腺癌细胞系中稳定过表达 ATOH8，结果发现 ATOH8过表达后明显抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，这和我们的研究假设恰好相反。并且我们还发现外源表达的ATOH8蛋白比内源表达的小，因此我们推测肿瘤细胞中可能存在ATOH8的异构体，而这些异构体可以促进乳腺癌细胞的转移。
　　为了验证我们的假设，我们对ATOH8的基因结构进行了分析，发现ATOH8确实可能通过不同的剪切方式产生不同的异构体，其中有2个异构体（ATOH8-V1和ATOH8-V2）的编码序列比ATOH8标准序列大，因此我们将这两个异构体选定为我们的研究目标。随后，我们通过测序证实ATOH8-V1和ATOH8-V2在乳腺癌细胞中广泛存在并有很强的表达。
　　进一步，我们根据ATOH8-V1和ATOH8-V2的特异性序列，制备了特异性抗体，然后检测了这两个异构体在乳腺癌细胞系中的表达情况。结果发现， ATOH8-V1和 ATOH8-V2在肿瘤细胞中高表达，且与细胞恶性程度呈正相关，转移能力强的细胞，其表达水平明显要高。随后，我们在乳腺癌细胞中稳定过表达这两个异构体，发现其可以显著增加细胞的迁移和侵袭能力，而用 shRNA沉默其表达后则会抑制细胞的迁移和侵袭。紧接着，我们又用小鼠移植瘤模型体内验证了这两个异构体的促转移作用，发现和体外实验结果一致，ATOH8-V1和 ATOH8-V2可以显著促进乳腺癌细胞的肺转移。为了进一步验证这两个异构体在肿瘤中的功能，我们又用免疫组化的方法检测了这两个异构体在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达情况，结果发现ATOH8-V1和ATOH8-V2在乳腺癌组织中高表达，且其表达水平与病人的生存预后呈负相关，表明这两个异构体在肿瘤的进展过程中确实发挥着重要的作用。机制上，我们发现 ATOH8-V1和ATOH8-V2可能通过促进MMP2和MMP9的表达来促进乳腺癌细胞的转移。
　　综上所述，我们在肿瘤细胞中发现了 ATOH8转录因子的两个新的异构体ATOH8-V1和ATOH8-V2，并通过体内外实验证明其在肿瘤转移过程中具有重要的作用。因此，ATOH8及其异构体可能可以作为对乳腺癌的预后判断的一个标志，并对临床治疗具有一定的指导意义。
　　第二部分
　　LPS（脂多糖）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分，为机体天然免疫系统识别细菌的一种常见的模式分子。大剂量的LPS可以通过TLR4信号通路诱导TNFα的大量表达，引起组织损伤。有趣的是，在肝特异性转录抑制剂D-(+)-氨基半乳糖（D-galactosamine，简称GalN）存在的情况下，极低量的LPS就可以引发严重组织损伤，诱发以大规模的肝细胞凋亡为特征的致死性肝炎。GalN主要通过耗竭肝细胞中的UTP来抑制转录，既往的研究结果提示，GalN通过抑制某些肝保护因子的转录，从而提高肝细胞对LPS或TNFα的敏感性。然而，绝大多数的这类肝保护因子目前还不清楚，这促使我们去筛选和鉴定这些能够限制LPS诱导的肝损伤的保护因子。
　　为了筛选这些肝保护因子，我们首先用基因芯片的方法分析了 LPS组和LPS/GalN组小鼠肝脏组织中基因表达的差异，结果发现差异表达的基因主要富集在I型干扰素相关通路中，其中大部分为I型干扰素诱导基因，比如Ifit1、Ifit2和ISG15等，因此我们猜测这些I型干扰素诱导基因可能在LPS/GalN引起的肝组织损伤中具有保护作用。为此，我们根据基因表达的差异程度以及其与细胞凋亡的相关性，挑选了包括Ifit1在内的9个I型干扰素诱导基因作为下一步研究的靶分子。这些基因可以被LPS快速的诱导，而在GalN存在的情况下，其诱导则会被显著的抑制。
　　为了研究这些候选基因在LPS诱导的肝损伤中的作用，我们通过Lentivirus系统在体外培养的肝细胞系中过表达这些基因，并检测其对TNFα和放线菌素D（Actinomycin D，简称Act.D）联合介导的细胞凋亡的影响。实验结果表明，Ifit1、Ifit2和Rsad2可以抑制由TNFα和Act.D联合介导的细胞凋亡，其中Ifit1的保护作用最强，因此我们将研究重点放在 Ifit1上。随后，我们设计了体内实验对Ifit1的肝保护作用进行进一步的验证，实验结果表明通过重组腺相关病毒rAAV8（recombinant adeno-associated virus serotype8）在肝脏中特异性的表达Ifit1可以保护小鼠抵抗LPS/GalN诱导的致死性肝炎。进一步的机制研究表明，Ifit1通过抑制JNK-Bim级联信号通路的活化，抑制TNFα诱导的肝细胞凋亡。最后，通过免疫共沉淀和免疫荧光等方法，我们发现Ifit1可以和支架蛋白Axin结合并抑制其介导的JNK的活化，进而抑制TNFα诱导的肝细胞凋亡，并且Ifit1对Axin活性的调节需要另一个分子MDFI的参与。
　　总之，我们的研究发现Ifit1具有很强的肝保护作用，可以抵抗LPS/GalN诱导（TNFα介导）的致死性肝炎。这些结果揭示了Ifit1在肝细胞凋亡的一个新功能，丰富了我们对该分子的认识，并提示 Ifit1可以作为炎性肝脏疾病治疗的一个潜在靶点，具有一定的医学和临床运用价值。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略语对照表

第一部分 ATOH8异构体促进乳腺癌的转移

第一章 引言

第一节 乳腺癌

第二节 乳腺癌的转移

第三节 bHLH转录因子与乳腺癌转移

第四节 ATOH8基因的功能及其与肿瘤的联系

第五节 研究的假设、目的及意义

第二章 实验材料和仪器

第一节 实验材料

第二节 实验试剂

第三节 实验仪器及其它相关服务

第三章 实验方法

第一节 细胞培养

第二节 qPCR检测基因的表达水平

第三节 Western Blot检测蛋白的表达水平

第四节 ATOH8及其异构体的Lentivirus载体构建及病毒包装

第五节 稳定细胞系的建立

第六节 乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的检测

第七节 乳腺癌细胞肺转移的检测

第八节 免疫化学染色检测蛋白在细胞或组织中的表达

第四章 实验结果

第一节 ATOH8对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

第二节 ATOH8异构体的分离鉴定

第三节 ATOH8异构体对乳腺癌转移的影响

第四节 ATOH8异构体在乳腺癌组织中的表达及其对预后的影响

第五节 ATOH8异构体促进乳腺癌转移的机制

第五章 分析讨论

第六章 结论

参考文献

第二部分 Ifit1对LPS/GalN诱导的致死性肝炎的保护

第一章 引言

第一节 LPS与炎症反应

第二节 D-galactosamine生物活性

第三节 LPS和D-galactosamine联合诱导的致死性肝炎

第四节 TNFα与肝组织损伤

第五节 rAAV8与基因治疗

第六节 研究的目的、内容及意义

第二章 实验材料和仪器

第一节 实验材料

第二节 实验试剂及其它相关服务

第三章 实验方法

第一节 LPS/GalN联合诱导致死性肝炎模型的建立

第二节 基因芯片分析差异表达基因

第三节 qPCR检测目的基因的mRNA水平

第四节 目的基因Lentivirus载体的构建及病毒包装

第五节 稳定细胞系的建立

第六节TNFα的细胞毒性检测

第七节rAAV8介导目的基因在小鼠肝脏中的表达

第八节 蛋白相互作用的检测

第四章 实验结果

第一节LPS/GalN诱导致死性肝炎

第二节 全基因表达谱芯片筛选差异表达基因

第三节 候选基因对Act.D+TNFα介导的肝细胞毒性的影响

第四节 Ifit1抑制Act.D+TNFα介导的肝细胞凋亡

第五节 体内表达Ifit1抑制LPS/GalN诱导的致死性肝炎

第六节Ifit1抑制JNK-Bim信号通路的活化

第七节Ifit1通过和Axin相互作用抑制TNFα诱导的肝细胞凋亡

第八节Ifit1对Axin活性的抑制作用需要MDFI的参与

第九节IFNα对LPS/GalN引起的致死性肝炎的影响

第五章 分析讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

论文发表情况

个人信息