纤溶酶原受体烯醇化酶1在前列腺癌细胞表面结合分子机制的研究

摘要

目的：纤溶酶通过参与细胞外基质降解、组织重构和血管发生等促进肿瘤的进展。烯醇化酶1（Enolase, ENO1）是主要纤溶酶原受体之一，在纤溶酶的激活和活性维持中发挥重要作用。前期研究发现肿瘤微环境中的 ENO1能够结合到前列腺癌细胞表面，作为纤溶酶原的受体促前列腺癌细胞迁移。然而，ENO1在前列腺癌表面结合的分子机制尚不清楚。本文寻找介导 ENO1在前列腺癌细胞表面结合的靶分子，从而为设计阻断 ENO1在细胞膜表面结合进而抑制纤溶酶原激活的多肽类药物或者小分子化合物提供依据。
　　方法：1.表达 ENO1-AP融合蛋白，建立通过测定碱性磷酸酶活性来检测ENO1与前列腺癌细胞结合能力的方法；2.检测BPH-1、Du145、PC3三种前列腺癌细胞表面ENO1的结合能力，结合生物信息学以及实时定量RT-PCR分析寻找可能与 ENO1相互作用的细胞膜蛋白；3.采用 RNA干扰技术敲低 KCNMA1的表达，检测ENO1在敲低KCNMA1基因的细胞表面的吸附能力；4. Western blot检测原核表达ENO1-GST融合蛋白与PC3细胞表面蛋白的相互作用;5. GST-pulldown实验验证ENO1与KCNMA1细胞膜外区端肽段的相互作用。
　　结果：ENO1-AP可以通过ENO1吸附在前列腺癌细胞表面；缺失了C-端与纤溶酶原结合位点的 ENO1仍然可以吸附在前列腺癌细胞表面；生物信息学结合 RT-PCR分析显示 KCNMA1可能是 ENO1在细胞膜表面结合的受体蛋白；KCNMA1敲低的前列腺癌细胞结合ENO1的能力明显降低；ENO1可以与内源性表达的KCNMA1以及真核表达的KCNMA1膜外N-端肽段相互作用。
　　结论：肿瘤微环境中的ENO1能够与前列腺癌细胞表达的跨膜蛋白KCNMA1的胞外区肽段相互作用，进而锚定在细胞表面作为纤溶酶原受体促进癌细胞迁移。

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第一章 前言

第一节 前列腺癌研究背景

1.1.1 前列腺癌概述

1.1.2 前列腺癌诊疗现状

1.1.3 活化间质与前列腺癌

1.1.4 雌激素在前列腺癌中的作用

第二节 纤溶酶/纤溶酶原研究背景

第三节 烯醇化酶1的研究背景

第四节 选题意义

第二章 材料与方法

第一节 主要仪器、试剂及溶液的配制

2.1.1 实验仪器

2.1.2 主要试剂

2.1.3 溶液的配制

第二节 实验方法

2.2.1 前列腺上皮细胞系培养

2.2.2 293T细胞培养

2.2.3 细胞复苏

2.2.4 细胞冻存

2.2.5 AP-ENO1过表达条件培养液的制备及碱性磷酸酶活性测定

2.2.6 碱性磷酸酶吸附测定

2.2.7 SiRNA 转染

2.2.8 慢病毒包装

2.2.9 细胞总RNA提取及浓度测定

2.2.10 逆转录合成CDNA

2.2.11 实时定量RT-PCR

2.2.12 KCNMA1膜外氨基端肽段表达载体构建

2.2.13 GST-ENO1表达载体的构建及表达纯化

2.2.14 SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色

2.2.15Western Blotting

第三章 结果

3.1 外源性ENO1在肿瘤细胞表面吸附研究方法的建立

3.1.1 ENO1-AP融合蛋白的条件培养液的制备

3.1.2 外源性ENO1与细胞表面结合

3.2 ENO1在细胞表面与纤溶酶原以外的分子相互作用

3.3 ENO1在不同前列腺上皮细胞系表面的结合分析

3.4 前列腺癌细胞系PC3高表达KCNMA1

3.4.1 生物信息学分析细胞膜上与ENO1相互作用的蛋白

3.4.2 RT-PCR检测可能与ENO1相互作用蛋白的基因表达

3.5 siRNA沉默KCNMA1的PC3与ENO1-AP的结合能力降低

3.5.1 siRNA抑制PC3细胞中KCNMA1的表达

3.5.2 KCNMA1表达降低的PC3与ENO1-AP结合能力减弱

3.6 shRNA沉默KCNMA1的PC3与ENO1-AP的结合能力降低

3.6.1 PC3细胞系中稳定转染shRNA表达载体敲低KCNMA1

3.6.2 稳定敲低KCNMA1的PC3-shKca1与ENO1-AP吸附能力降低

3.7 ENO1在体外与细胞表面KCNMA1相互作用

3.8 ENO1与KCNMA1膜外的N-端肽段相互作用

第四章 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历