肠道病毒71型手足口病ELISA检测体系的建立

摘要

手足口病（Hand-foot-mouth disease）是由多种肠道病毒引起的传染性疾病，患者主要是5岁以下的儿童。虽然手足口病的临床症状表现为轻微的发疹及发烧症状，但是 EV71病毒的感染能够引发严重的神经疾病，如致死性脑炎，无菌性脑膜炎，急性松弛性麻痹，而CA16病毒的感染一般不会导致这些疾病。
　　EV71病毒于1969年在美国的一个9个月大患有致死性脑炎的婴儿体中首次分离得到，它隶属于小 RNA病毒科肠道 A种病毒。目前由于没有合适的疫苗和抗病毒药物，因此，对感染 EV71型病毒的早期诊断和鉴别诊断，以及及时预防就成为了关键。
　　本文以建立 EV71病毒酶联免疫吸附（ELISA）检测体系并应用于临床研究为目的。主要内容包括免疫原的制备，单抗的制备、筛选和配对，双抗夹心法体系和间接法体系建立、优化以及性能验证等几个部分。我们首先制备了免疫原，对 BALB/C雌性小鼠进行了免疫，通过杂交瘤筛选技术得到4株能分泌单抗的细胞株，并采用了腹腔注射杂交瘤的方法得到大量高纯度的单抗。然后建立了两种不同的 ELISA检测体系：一种是定量检测 EV71病毒的双抗夹心法体系，另一种是定性检测抗 EV71型病毒早期 IgM的间接法体系，并对这两种体系的包被量、包被液、酶标抗体、标准品等方面进行了优化。在最后对间接法体系的性能进行了验证，并得到了较好的结果。本研究有望用于临床快速体外检测EV71病毒患者感染病况。图24幅，表20个，参考文献62篇。

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符号说明

第一章前言

第一节EV71型手足口病研究现状

1.1.1 EV71型手足口病概述

1.1.2肠道病毒71型结构特征

1.1.3肠道病毒71型发病机制

1.1.4肠道病毒71型疫苗的研究现状

1.1.5手足口病常用的检测方法

第二节研究意义、目的和主要内容

第二章肠道病毒71型单抗筛选

第一节实验材料

2.1.1细胞株、实验动物、pGEX-6P-1-VP1重组质粒

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

2.1.4常用试剂配制

第二节实验方法

2.2.1 VP1蛋白的扩大表达、纯化

2.2.2肠道病毒71型单抗的筛选

2.2.3腹腔注射法生产单抗

第三节实验结果与分析

2.3.1 VP1蛋白的试表达

2.3.2 VP1蛋白GST柱的纯化结果图

2.3.3单抗的纯化

2.3.4测定单抗的效价

第三章肠道病毒71型双抗夹心ELISA法检测体系的建立

第一节实验材料

3.1.1单抗

3.1.2主要试剂

3.1.3实验仪器

3.1.4常用溶液配制

第二节实验方法

3.2.1双抗夹心ELISA方法的实验原理

3.2.2方法

第三节实验结果与分析

3.3.1酶标抗体（3B7-HRP）浓度的优化

3.3.2 EV71标准品稀释范围的优化

3.3.3单抗9G6包被量的优化

3.3.4包被缓冲液的优化

3.3.5封闭液的优化

3.3.6包被时间和包被温度的优化

3.3.7绘制标准曲线

第四章肠道病毒71型间接ELSIA法检测体系的建立

第一节实验材料

4.1.1抗原、患者血清

4.1.2主要试剂

4.1.3实验仪器

4.1.4常用缓冲液的配制

第二节实验方法

4.2.1间接ELSIA法的原理

4.2.2间接ELISA方法的基本操作步骤

4.2.3方法

第三节 实验结果与分析

4.3.1间接ELISA法相关条件的确定

4.3.2间接ELISA体系的验证

4.3.3间接ELISA法体系的稳定性实验

4.3.4同购买的商品试剂盒进行比较

第五章全文总结与讨论

参考文献

致谢

个人简历