miR-200b-3p抑制对足细胞TRPC6通道及BKCa通道的影响

摘要

成熟的足细胞，也称肾小球上皮细胞，是依附于肾小球基底膜（GBM）的高度分化的细胞。足细胞由胞体、主突及足突3部分组成，由于其特殊的结构，与肾小球基底膜一起构成了肾小球血液滤过屏障，对于阻止蛋白丢失起到重要作用。近来，越来越多的实验证明许多肾脏疾病的发生及发展与足细胞的损伤及功能的异常有密切的联系。
　　microRNA（miRNA）是一类内源性单链非编码RNA分子，长度约为22个核苷酸。它主要通过与靶基因完全或不完全互补配对结合，进而对mRNA进行翻译抑制或诱导其降解，来调控基因的转录与表达。miRNA在许多物种中均有表达包括植物、动物甚至一些藻类。事实上，一些研究已经表明在足细胞中敲除Dicer或Drosha等对miRNA的产生具有重要作用的酶，会导致蛋白尿及肾小球硬化症，说明miRNA对于维持足细胞的功能的稳定具有重要作用。
　　miR-200b是 miR-200家族中的一员，miR-200b-3p是由小鼠 pre-miR-200b的3’臂剪切加工得到。已有很多研究表明miR-200b-3p对于上皮细胞-间质细胞的转化（EMT）起到重要的调控作用，比如过表达 miR-200b-3p可以抑制膀胱癌中上皮细胞到间质细胞的转移。关于miR-200b-3p的研究大多集中在癌症方面，对于其在肾脏及与肾脏相关的细胞方面的研究却较少。Raman Agrawal等的研究表明miR-200b-3p家族在肾脏中有丰富的表达；Li等研究表明miR-200b-3p可以通过靶向调控RSAD2来促进足细胞的分化。所以miR-200b-3p对于维持足细胞的生理功能发挥重要作用。
　　瞬时受体阳离子通道6(TRPC6)是一种可以通透Ca2+的离子通道。已有研究报道TRPC6基因突变会导致局灶节段性肾小球硬化(FSGS)；并且TRPC6的过渡激活会激活钙调神经磷酸化酶（Calcineurin）进而导致细胞骨架蛋白 F-actin的重排，引起足细胞的损伤及蛋白尿的产生。所以TRPC6对足细胞功能的稳定具有重要作用。
　　大电导钙激活钾通道（BKCa）是一种受胞内 Ca2+与膜电位双重调控的离子通道。由于BKCa与TRPC6通道是在足细胞中共表达的离子通道，所以TRPC6可能为BKCa的激活提供Ca2+源。并且BKCa对于调控足细胞内Ca2+的自平衡发挥重要作用。因此，本实验主要研究抑制miR-200b-3p对足细胞TRPC6及BKCa的影响。
　　实验采用条件性永生化足细胞系（MPC5），分化成熟后，使用全细胞膜片钳技术记录CON组、miR-200b-3p inhibitor组和siRNA CON组足细胞的TRPC6及BKCa离子通道的电流。
　　主要实验结果如下：
　　1、下调miR-200b-3p抑制了TRPC6通道的电流及蛋白表达：结果显示下调miR-200b-3p抑制了足细胞TRPC6 mRNA转录及蛋白表达水平，并减小了足细胞TRPC6电流幅值。
　　2、下调miR-200b-3p抑制了BKCa通道的电流及mRNA表达：结果显示下调 miR-200b-3p对抑制了足细胞 BKCa mRNA表达转录水平，并减小了足细胞BKCa电流幅值，使其I-V曲线斜率减小，激活曲线向去极化方向移动。
　　3、下调 miR-200b-3p对足细胞内 Ca2+浓度的影响：结果显示，下调miR-200b-3p导致胞内Ca2+浓度下降。
　　4、抑制TRPC6通道对BKCa通道的影响：结果显示抑制TRPC6通道减小了足细胞BKCa电流幅值，使其I-V曲线斜率减小，激活曲线向去极化方向移动。
　　综上所述，下调miR-200b-3p抑制了足细胞TRPC6及BKCa通道的转录水平及蛋白表达，减小了 TRPC6及 BKCa通道的电流，并减少了足细胞[Ca]i，同时实验还发现抑制 TRPC6通道会造成 BKCa通道电流的抑制。这说明下调miR-200b-3p抑制TRPC6的电流，使得足细胞[Ca]i水平下降，这可能减少了BKCa通道激活所需的Ca2+源，使得BKCa通道电流抑制。

目录

声明

本文主要缩略语表

第一章 引言

第一节 miR-200b-3p的生理作用及研究状况

第二节 足细胞的结构与生理功能

第三节 TRPC6及BKCa离子通道的研究状况

第四节 膜片钳技术及其应用

第五节 本论文的研究目的、意义及内容

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 实验结果

第一节 miR-200b-3p抑制对TRPC6离子通道电流的影响

第二节 miR-200b-3p抑制对BKCa离子通道电流的影响

第三节 miR-200b-3p下调对TRPC6离子通道转录及表达水平的影响

第四节 miR-200b-3p下调对BKCa离子通道转录及表达水平的影响

第五节 miR-200b-3p抑制对足细胞胞内钙离子[Ca2+]i浓度的影响

第六节 TRPC6抑制对BKCa离子通道转录及表达水平的影响

第七节 TRPC6抑制对BKCa离子通道电流的影响

第四章 讨论

第五章 结论与展望

第一节 主要结论

第二节 研究展望

参考文献

致谢

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