猪血细胞中主要生物活性物质联合提取及性质研究

摘要

猪血细胞作为一种优质的蛋白质资源，因血细胞碎片的腥味以及血红素的颜色，在食品工业中的应用受到限制。开发猪血细胞不仅能够增加用于生产药品、食品等的原料资源，提高猪血细胞的利用率，而且能够减少屠宰场废弃物对环境的污染，具有良好的社会和经济效益。本论文从猪血细胞中联合提取超氧化物歧化酶(SOD)、水解蛋白和血红素，并对三种活性物质的相关性质进行分析。主要研究内容及结果如下:
　　1.SOD的提取、分离及纯化以SOD的比活力为指标，在单因素基础上，通过响应面分析得到热变性法提取SOD的最适工艺条件为水浴温度为66℃，水浴时间为25min，硫酸铜添加量为3.10％。在此条件下，粗酶液的比活力为167.74U/mg。经凝胶柱层析纯化后酶液的比活力为6594.55U/mg，活力回收率为62.15％，纯化倍数为39.14。
　　2.SOD的性质研究经紫外光谱分析纯化物在262nm处有最大吸收峰。敏感性测试表明该纯化物为Cu，Zn-SOD。原子吸收测定纯化物中铜锌个数之比约为1∶1。聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示纯化物已达到电泳纯。红外光谱分析SOD的二级结构以β-折叠为主，约占38.8％。金属离子对SOD活力的影响表现为:Na+、K+、Zn2+随浓度的增加激活作用增强，而随浓度的增加，Ba2+、Cu2+、Ca2+对SOD的激活作用减弱，Mg2+、Fe2+、Al3+则表现为高浓度抑制，低浓度激活。不同糖类对SOD的活力影响:低浓度时，D-果糖、蔗糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、葡萄糖对SOD有一定的稳定作用。高浓度时，D-甘露糖、D-木糖对SOD有一定的稳定作用，L-鼠李糖对SOD活力影响较小。变性剂对SOD活力的影响:十二烷基硫酸钠(SDS)和尿素随浓度的增大抑制作用增强;乙二胺四乙酸(EDTA)随浓度的增加抑制作用减弱。有机酸对SOD活力的影响表现为:草酸和柠檬酸对SOD活力抑制作用较强。SOD对部分自由基都具有明显的清除活性，其中对超氧阴离子的清除活性最强。
　　3.血红素和水解蛋白联合提取工艺优化采用血红素得率为指标，选择最适水解蛋白酶。在单因素试验基础上，通过响应面分析优化水解条件，得到碱性蛋白酶水解SOD提取残渣的最适条件为:酶解温度为51℃，pH为8.4，底物浓度为9％，酶与底物之比为1.3％，在此条件下，血红素得率为26.76％，水解蛋白得率为49.32％。
　　4.血红素的性质研究紫外光谱和红外光谱分析确定提取物为血红素。血红素中含有蛋白质69.62％，血红素为20.72％，铁为1.70％。热分析表明血红素从195.28℃开始进行缓慢分解，具有较好的热稳定性。人体肠胃消化模拟评价表明，血红素的生物利用率为97.66％。
　　5.水解蛋白的性质研究水解蛋白含有蛋白质85.98％，分子量主要分布在2000～3000Da，约占51.43％;热分析表明水解蛋白从139.23℃开始进行缓慢分解，具有较好的热稳定性。水解蛋白与猪血细胞粉相比，功能特性有较大提高。其体外消化率为86.28％。抗氧化活性试验表明，水解蛋白对羟基自由基和DPPH自由基具有较好的清除作用，能够抑制脂质过氧化，同时具有较强的总抗氧化能力和金属螯合能力。

目录

声明

摘要

符号与缩写

1 绪论

1．1 血液概述

1．1．1 血浆概述

1．1．2 血细胞概述

1．1．3 血液的利用概况

1．2 超氧化物歧化酶的研究现状

1．2．1 超氧化物歧化酶的发现、种类和分布

1．2．2 超氧化物歧化酶的结构

1．2．3 超氧化物歧化酶的提取及纯化

1．2．4 超氧化物歧化酶的性质研究

1．2．5 超氧化物歧化酶的应用研究进展

1．3 血红素的研究现状

1．3．1 血红素的结构及性质

1．3．2 血红素的提取方法

1．3．3 血红素的应用研究进展

1．4 立题依据和意义

1．5 本课题研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 试验材料、试剂和仪器

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验仪器

2．2 超氧化物歧化酶的提取、分离及纯化

2．2．1 全血、血浆和血细胞各成分分析

2．2．2 超氧化物歧化酶的提取工艺研究

2．2．3 超氧化物歧化酶的纯化

2．3 超氧化物歧化酶的性质研究

2．3．1 紫外光谱分析

2．3．2 敏感性测试

2．3．3 铜，锌含量的测定

2．3．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3．5 红外光谱分析

2．3．6 不同化学物质对超氧化物歧化酶活力的影响

2．3．7 超氧化物歧化酶的抗氧化活性

2．4 血红素和水解蛋白的联合提取工艺研究

2．4．1 测定方法

2．4．2 血红素与水解蛋白的联合提取工艺流程

2．4．3 血红素与水解蛋白的联合提取单因素试验

2．4．4 血红素与水解蛋白的联合提取响应面试验

2．5 血红素的性质研究

2．5．1 主要成分分析

2．5．2 紫外光谱分析

2．5．3 红外光谱分析

2．5．4 热稳定性分析

2．5．5 生物利用率的评价

2．6 水解蛋白的性质研究

2．6．1 主要成分分析

2．6．2 分子量及其分布测定

2．6．3 热稳定性

2．6．4 水解蛋白的功能特性

2．6．5 水解蛋白的消化特性

2．6．6 水解蛋白的抗氧化活性

3 结果与分析

3．1 超氧化物歧化酶的提取、分离及纯化

3．1．1 全血、血浆及血细胞各成分分析

3．1．2 超氧化物歧化酶提取工艺研究

3．1．3 超氧化物歧化酶(SOD)的纯化

3．2 超氧化物歧化酶的性质研究

3．2．1 紫外／可见光谱分析

3．2．2 敏感性测试

3．2．3 铜，锌含量测定

3．2．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．2．5 红外光谱分析

3．2．6 不同化学物质对超氧化物歧化酶活力的影响

3．2．7 超氧化物歧化酶的体外抗氧化活性

3．3 血红素和水解蛋白的联合提取工艺研究

3．3．1 血红素和水解蛋白的联合提取单因素试验

3．3．2 血红素与水解蛋白的联合提取响应面试验

3．4 血红素性质分析

3．4．1 主要成分分析

3．4．2 紫外光谱分析

3．4．3 红外光谱分析

3．4．4 热稳定性

3．4．5 生物利用率的评价

3．5 水解蛋白性质分析

3．5．1 主要成分分析

3．5．2 分子量及其分布测定

3．5．3 热稳定性

3．5．4 水解蛋白的功能特性

3．5．5 水解蛋白的消化特性

3．5．6 水解蛋台的抗氧化活性

结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的论文